在“三明治”培養(yǎng)大鼠原代肝細胞中研究利福平及聯(lián)用丹參酮ⅡA對普伐他汀經(jīng)BSEP轉(zhuǎn)運的影響

劉 蕾，楊玉潔，王 凌，蔣學(xué)華

(四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041)

膽汁酸外排泵(bile salte export pump，BSEP)是重要的膽汁酸外排轉(zhuǎn)運體，主要介導(dǎo)一價膽酸鹽的轉(zhuǎn)運。BSEP介導(dǎo)的膽汁酸外排在膽汁酸循環(huán)中是重要的限速步驟。有研究表明，編碼BSEP的基因ABCB11發(fā)生突變，可導(dǎo)致進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積，抑制BSEP的轉(zhuǎn)運能力也可導(dǎo)致膽汁淤積[1]。利福平(rifampin，RFP)是治療結(jié)核病的一線藥物。在臨床使用中，RFP給藥劑量大，服藥周期長，常引發(fā)肝損傷等不良反應(yīng)，其中，以膽汁淤積型肝損傷最為常見[2]。目前，RFP致淤膽的機制尚不清楚，是否可能通過抑制膽汁酸轉(zhuǎn)運體BSEP的轉(zhuǎn)運能力導(dǎo)致膽汁淤積，需要進一步研究。丹參酮 ⅡA(tanshinone ⅡA，TAN ⅡA)是中藥丹參的脂溶性活性成分，具有抗氧化、抗纖維化、保肝等作用。TAN ⅡA能改善腫瘤壞死因子和過氧化氫所致的肝細胞損傷[3]，也能激活NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2， Nrf2)信號通路，預(yù)防對乙酰氨基酚引起的肝損傷[4]。有研究表明，BSEP的啟動子區(qū)域存在Nrf2的結(jié)合位點[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TAN ⅡA能夠激活Nrf2，誘導(dǎo)下游BSEP的表達。但目前尚未有研究報道TAN ⅡA對BSEP轉(zhuǎn)運能力的影響，所以我們猜想，TAN ⅡA是否能增加轉(zhuǎn)運體BSEP的轉(zhuǎn)運能力，對抗RFP所致的膽汁淤積型肝損傷。

“三明治”培養(yǎng)大鼠原代肝細胞模型(sandwich-cultured rat hepatocytes，SCRH)是指將大鼠原代肝細胞鋪于鼠尾膠與基質(zhì)膠之間，形成夾層培養(yǎng)。原代肝細胞在該模型下培養(yǎng)3～5 d，肝細胞間能夠形成膽管樣結(jié)構(gòu)，且轉(zhuǎn)運體和代謝酶的表達維持較高水平，可以較好地模擬體內(nèi)環(huán)境，是體外研究肝臟轉(zhuǎn)運體功能的主要模型[6]。本文旨在SCRH中考察RFP及聯(lián)用TAN ⅡA對BSEP轉(zhuǎn)運能力的影響，進一步闡明RFP導(dǎo)致膽汁淤積的機制，同時也為尋找有效減輕RFP膽汁淤積的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250±20)g，由成都達碩實驗動物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030。采用標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水及進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境采用晝夜對半的循環(huán)模式，控制相對濕度(75±15)%，溫度(25±5)℃。所有動物實驗均按照四川大學(xué)關(guān)于實驗動物的飼養(yǎng)和實驗準則進行，并且通過了四川大學(xué)華西藥學(xué)院動物保護委員會批準。

1.2 藥物與試劑RFP(純度99%，批號：S01023 YA14)、TAN ⅡA(純度98%，批號：Y20J8C49264)，均購自上海源葉生物科技有限公司；格列本脲(純度99%，批號：A0225A，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；普伐他汀(純度98%，批號：C1721027，阿拉丁)；卡馬西平(純度99.7%，批號：100142-201004，中國藥品生物制品檢定所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、BSA牛血清白蛋白，均購自萬類生物科技有限公司；EGTA購自Sigma公司；含Ca2+/Mg2+Hanks緩沖液、不含Ca2+/Mg2+Hanks緩沖液，購自Solarbio公司；Ⅱ型膠原酶，購自Gibco公司；Matrigel膠、鼠尾膠，均購自Corning公司；甲醇、乙腈均為色譜級，購自Spectrum公司；色譜級甲酸，購自DIKMA公司。

1.3 儀器API 3000三重四極桿質(zhì)譜(美國AB Sciex公司)聯(lián)用高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)；Minipuls 3蠕動泵法國(GILSON)；渦旋振蕩器、酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；H-1600A臺式高速離心機 (上海利鑫堅離心機有限公司)；倒置相差生物顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱日本(Sanyo公司)。

1.4 SCRH模型的建立采用半原位膠原酶灌流法分離大鼠原代肝細胞。禁食24 h的SD大鼠腹腔注射500 IU·kg-1肝素鈉抗凝，并用4 mg·kg-1水合氯醛麻醉。75%酒精消毒大鼠腹部，在無菌條件下打開腹腔，游離門靜脈與下腔靜脈，門靜脈插管。用EGTA灌流液勻速灌注，流速為20 mL·min-1，待肝臟腫脹時剪開下腔靜脈，繼續(xù)灌注10 min肝臟變成土黃色后停止灌流；完整摘除肝臟，用無菌PBS清洗3次，在無菌條件下鈍性撕破肝包膜，撕碎肝臟并轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加入20 mL Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴中震蕩7 min；100目篩網(wǎng)過濾肝細胞懸液，加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基20 mL，50×g、4 ℃離心3 min，重復(fù)2次，用10 mL相同培養(yǎng)基重懸沉淀，加入5 mL密度為1.08 kg·L-1的Percoll，混勻后，200×g、4 ℃離心5 min，所得沉淀以含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，將細胞活率在90%以上的細胞按5×108·L-1的密度接種于鋪有鼠尾膠的細胞培養(yǎng)板上，4 h后更換新的含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，以去除未貼壁細胞。培養(yǎng)24 h后，更換含Matrigel膠(0.25 g·L-1)的無血清DMEM培養(yǎng)基，以形成“三明治”夾層狀態(tài)，隨后每24 h更換新的無血清DMEM培養(yǎng)基，直至d 4長出膽管。

1.5 MTT實驗將新鮮分離的大鼠原代肝細胞按2.5×104個/孔接種于鋪有鼠尾膠的96孔板中，按“三明治”模型的培養(yǎng)條件培養(yǎng)至d 4，分別以RFP(0、0.5、1、2、5、10、25、50、80、100 μmol·L-1)，TAN ⅡA(0、0.5、1、2、5、10、25、50、80、100 μmol·L-1)聯(lián)用50 μmol·L-1RFP，以及格列本脲(0、1、2、4、10、20、50、100、160、200 μmol·L-1)處理細胞12、24、48 h；以濃度為0、0.2、0.5、1、2、5 μmol·L-1普伐他汀處理細胞6、12、24 h。于相應(yīng)的時間點棄去含藥培養(yǎng)基，改用5 g·L-1MTT孵育細胞4 h，吸棄MTT，加入150 μL DMSO震蕩10 min以充分溶解結(jié)晶物甲臜。在492 nm波長下測定各孔的吸光度值。細胞抑制率計算公式為：細胞抑制率/%=(Acontrol-Atest)/Acontrol×100%

1.6 液相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：phenomenex Luna 3u C18(2)(50 mm×2.00 mm 3 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸的水溶液；B相為乙腈，梯度洗脫(0～0.5 min 10% B；0.51～1.5 min 10%～90% B；1.5～3 min 90% B；3.01～4.5 min 90%～10% B；4.51～5 min 10% B)；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40 ℃，進樣量10 μL。離子源為ESI，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，正離子掃描，離子噴射電壓(IS)為5.0 kV；氣簾氣(CUR)為82.74 kPa；碰撞氣(CAD)為68.95 kPa；霧化氣(NEB)為55.16 kPa。普伐他汀和內(nèi)標卡馬西平的離子對分別為m/z 447.1→327.4、m/z 237.1→194.1，去簇電壓(DP)分別為79 V、20 V，碰撞能量分別為30 V、12 V。

1.7 溶液配制用90%的甲醇溶液配制濃度為240.0 mg·L-1的普伐他汀儲備液和濃度為3.000 g·L-1的卡馬西平儲備液。將普伐他汀儲備液用50%的甲醇溶液繼續(xù)稀釋為0.600、1.200、3.000、6.000、12.00、24.00、30.00 mg·L-1的系列普伐他汀工作溶液。將卡馬西平儲備液用50%的甲醇溶液稀釋為4.500 mg·L-1的內(nèi)標溶液。

1.8 原代肝細胞樣品的處理方法取原代肝細胞裂解液90 μL，向其中加入50%甲醇溶液10 μL以及內(nèi)標工作溶液10 μL，渦旋1 min；加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液80 μL入進樣瓶中，依次放置于自動進樣器樣品盤中，進樣10 μL分析。記錄普伐他汀面積(Aanalyte)與內(nèi)標峰面積(AIS)，代入標準曲線中，計算樣品中濃度。

1.9 細胞轉(zhuǎn)運實驗普伐他汀是BSEP的已知底物[7]，本文用普伐他汀在膽管中的濃度評價RFP及聯(lián)用TAN ⅡA對BSEP轉(zhuǎn)運能力的影響。SCRH形成膽管結(jié)構(gòu)后，用含Ca2+/Mg2+的Hanks孵育細胞，細胞間的膽管結(jié)構(gòu)保持完整，進入細胞的普伐他汀可被轉(zhuǎn)運到膽管中；用不含Ca2+/Mg2+的Hanks孵育細胞，細胞間膽管結(jié)構(gòu)被破壞，細胞內(nèi)的普伐他汀被轉(zhuǎn)運到培養(yǎng)液里，由此差值可得排入膽管中普伐他汀的濃度[8]。SCRH培養(yǎng)至d 4，分別以格列本脲(100 μmol·L-1)、RFP(10、25、50 μmol·L-1)、TAN ⅡA(5、10、20 μmol·L-1)聯(lián)用50 μmol·L-1RFP處理細胞12、24、48 h。其中，格列本脲是BSEP的已知抑制劑，作為陽性對照藥。隨后用37 ℃預(yù)熱的含Ca2+/Mg2+或不含Ca2+/Mg2+的Hanks孵育細胞15 min后吸棄，加入含1 μmol·L-1普伐他汀的Hanks孵育20 min，用冰冷的Hanks快速清洗細胞3次終止轉(zhuǎn)運，用反復(fù)凍融法裂解細胞并進行BCA蛋白定量。細胞裂解液樣品按“1.8”項下操作，計算樣品中普伐他汀的濃度及膽管外排指數(shù)(bile efflux index，BEI)：BEI=(Acell+bile-Acell)/Acell+bile×100%，其中，Acell+bile為在含Ca2+/Mg2+時細胞和膽管結(jié)構(gòu)內(nèi)普伐他汀的蓄積量；Acell為在不含Ca2+/Mg2+時細胞內(nèi)普伐他汀的蓄積量。

2 結(jié)果

2.1 藥物對細胞活性的影響Fig 1的MTT結(jié)果顯示，RFP、TAN ⅡA聯(lián)用RFP(50 μmol·L-1)、格列本脲、普伐他汀濃度分別在0～50 μmol·L-1、0～25 μmol·L-1、0～100 μmol·L-1、0～2 μmol·L-1范圍內(nèi)，對細胞的生長抑制率低于20%，幾乎不抑制細胞生長。最終選定RFP的給藥濃度為10、25、50 μmol·L-1，TAN ⅡA的給藥濃度為5、10、20 μmol·L-1，格列本脲的給藥濃度為100 μmol·L-1，普伐他汀的給藥濃度為1 μmol·L-1。

2.2 普伐他汀UPLC-MS/MS的方法學(xué)考察在選定的液相-質(zhì)譜條件下，分別測定空白細胞裂解液、空白細胞裂解液+普伐他汀、空白細胞裂解液+卡馬西平、空白細胞裂解液+普伐他汀+卡馬西平。Fig 2結(jié)果表明，細胞裂解液中的其他雜質(zhì)不干擾普伐他汀和內(nèi)標卡馬西平的分離測定，普伐他汀和卡馬西平的保留時間分別為1.78 min、1.85 min。

Fig 1 Growth inhibitions on rat primary hepatocytes by RFP(A), TAN ⅡA(B), glibenclamide(C),

Fig 2 Representative chromatograms of pravastatin and internal standard(carbamazepine) in cell lysates

A: Blank rat primary hepatocytes lysis solution; B: Blank rat primary hepatocytes lysis solution with pravastatin; C: Blank rat primary hepatocytes lysis solution with carbamazepine; D: Blank rat primary hepatocytes lysis solution with pravastatin and carbamazepine.

Fig 3 The standard curve diagram of pravastatin in cells

按“1.8”項下操作，將普伐他汀系列工作溶液加入空白細胞裂解液中，制備成濃度為60.0、120.0、300.0、600.0、1 200、2 400、3 000 μg·L-1的標準曲線溶液，以待測物和內(nèi)標峰面積的比值(Y)為縱坐標，以普伐他汀的濃度為橫坐標，進行加權(quán)回歸，權(quán)重為1/C2，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)：Y=0.00148X+0.0173(r2=0.9954),表明在60.00～3 000 μg·L-1濃度范圍內(nèi)普伐他汀線性良好，定量下限為60.00 μg·L-1。標準曲線代表圖見Fig 3。

按“1.8”項下操作，用空白細胞裂解液將普伐他汀工作溶液稀釋為60.00、120.0、600.0、2 250 μg·L-1的極低、低、中、高4個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度制備6份。其中，用極低、低、中、高濃度的質(zhì)控樣品考察精密度與準確度。由Tab 1結(jié)果可知，普伐他汀極低、低、中、高濃度質(zhì)控樣品的準確度分別為(104.67±4.27)%、(106.80±6.45)%、(107.53±8.56)%、(90.80±4.49)%，表明方法準確度良好，日內(nèi)精密度在2.41%～11.74%之內(nèi)，日間精密度在4.17%～11.93%之內(nèi)，表明方法精密度良好。用低、中、高濃度的質(zhì)控樣品考察提取回收率，Tab 1結(jié)果表明，低、中、高3個濃度樣品的提取回收率分別為106.06%、88.39%、108.09%。用低、高兩種不同濃度的質(zhì)控樣品考察基質(zhì)效應(yīng)與穩(wěn)定性，結(jié)果如Tab 2所示，低、高濃度普伐他汀的相對基質(zhì)效分別是3.8%、4.4%。穩(wěn)定性結(jié)果如Tab 3所示，與0 h相比，室溫放置4 h、自動進樣器(4 ℃)放置8 h、-70 ℃放置10 d以及反復(fù)凍融3次后，樣品測得值的偏差均小于15%。因此，普伐他汀在以上條件下穩(wěn)定性良好。

Tab 1 Accuracy, precision and extraction recovery of pravastatin in cell

Tab 2 Matrix effect of pravastatin in cell

Tab 3 Stability of pravastatin in cell

2.3 普伐他汀在SCRH的膽管外排格列本脲、RFP、TAN ⅡA孵育細胞12、24、48 h后，普伐他汀在膽管中的濃度變化結(jié)果如Fig 4所示。與空白對照組比，格列本脲明顯降低膽管內(nèi)普伐他汀的濃度(P<0.01)，RFP也能降低膽管內(nèi)普伐他汀的濃度，其中RFP高濃度組處理細胞12、24、48 h后，膽管內(nèi)的普伐他汀濃度分別降低至對照組的22.2%、24.2%、19.6%，差異具有顯著性(P<0.01)；與高濃度RFP組比，當(dāng)RFP與不同濃度的TAN ⅡA聯(lián)用后，膽管內(nèi)普伐他汀的濃度呈增加趨勢，其中RFP與TAN ⅡA高劑量組聯(lián)合用藥處理細胞12、24、48 h后，膽管內(nèi)普伐他汀濃度分別增加至RFP高劑量組的3.81倍、2.51倍、3.50倍，差異具有顯著性(P<0.05)。

此外，BEI也是評價藥物膽管外排的重要指標，格列本脲、RFP、TAN ⅡA對普伐他汀BEI的影響結(jié)果見Fig 5。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，格列本脲能明顯降低普伐他汀的BEI(P<0.05)，RFP也能降低普伐他汀的BEI，其中高濃度RFP處理細胞12、24、48 h均能明顯降低普伐他汀的BEI，分別是對照組的42.6%、45.2%、38.4%，差異具有顯著性(P<0.01)；與高濃度RFP組相比，RFP與TAN ⅡA聯(lián)用后，普伐他汀的BEI呈上調(diào)趨勢，其中高濃度TAN ⅡA上調(diào)趨勢最明顯，處理細胞12、24、48 h后，普伐他汀的BEI分別增加至高濃度RFP組的1.51倍、1.91倍、2.74倍，差異具有顯著性(P<0.01)。由此說明，RFP能夠抑制BSEP的轉(zhuǎn)運能力，TAN ⅡA與RFP聯(lián)用后能夠逆轉(zhuǎn)RFP對BSEP轉(zhuǎn)運能力的抑制作用。提示RFP致淤膽的機制可能與抑制BSEP的轉(zhuǎn)運能力有關(guān)，TAN ⅡA能夠上調(diào)BSEP的轉(zhuǎn)運能力，具有治療RFP所致膽汁淤積的潛力。

3 討論

原代肝細胞最經(jīng)典的提取方法是Seglen兩步灌流法[9]，但該法膠原酶用量大、灌流時間長，本文選用半原位膠原酶灌流法提取大鼠原代肝細胞，并對該方法進行了改良。分別對膠原酶的類別、濃度、溫度、消化時間等條件進行考察，發(fā)現(xiàn)影響原代細胞得率和活率的關(guān)鍵因素包括：① 膠原酶的類別：本研究分別嘗試用Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶提取原代肝細胞，發(fā)現(xiàn)在相同操作下，Ⅱ型膠原酶處理后的細胞得率高于Ⅰ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶；② 灌流速度：灌流速度快會對肝臟造成機械性損傷，降低細胞活率；灌流速度慢，肝臟易淤血，導(dǎo)致灌流不充分；反復(fù)摸索后發(fā)現(xiàn)，20 mL·min-1的灌流速度能快速清除肝臟淤血并能保證細胞活率；③ 消化時間：膠原酶消化時間過短，細胞得率低；消化時間長，細胞因缺氧而死亡，影響細胞活率。因此，本文最終采用42 ℃、0.05% Ⅱ型膠原酶離體消化肝臟10 min。相比于傳統(tǒng)方法，該實驗條件既保證了細胞得率和活率，又大大降低了實驗成本。

Fig 4 Effects of rifampin and tanshinone ⅡA on accumulation of pravastatin in bile

1：Control;2:Glibenclamide;3:RFP 10;4:RFP 25;5:RFP 50;6:RFP 50+TAN 5;7:RFP 50+TAN 10;8:RFP 50+TAN 20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsRFP 50 group

用HPLC-MS/MS測定普伐他汀血樣濃度時，常用的樣品前處理方法有液-液萃取法[10]、固-液萃取法[11]。這些方法操作繁瑣、實驗成本高。相比于血液樣品，細胞樣品成分較單一，本文采用乙腈沉淀蛋白法處理樣品，發(fā)現(xiàn)普伐他汀響應(yīng)好、回收率高，滿足生物樣品的分析要求。此外，流動相也是影響藥物定量分析的重要因素，通過考察乙腈-水(補充0.1%甲酸)、甲醇-水(補充0.1%甲酸)對普伐他汀測定的影響，發(fā)現(xiàn)有機相為乙腈時藥物峰形平滑，響應(yīng)好；有機相為甲醇時藥物峰出現(xiàn)裂峰，響應(yīng)低，且有拖尾現(xiàn)象。故最終確定用乙腈沉淀蛋白法處理樣品，流動相用乙腈-水(補充0.1%甲酸)。

Fig 5 Effects of rifampin and tanshinone ⅡA on BEI of

1：Control;2:Glibenclamide;3:RFP 10;4:RFP 25;5:RFP 50;6:RFP 50+TAN 5;7:RFP 50+TAN 10;8:RFP 50+TAN 20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsRFP 50 group

藥源性肝損傷是藥物撤市的原因之一，國際醫(yī)學(xué)組織理事會將藥物性肝損傷分為3類：肝細胞損傷型、膽汁淤積型和混合型[12]。利福平造成的肝損傷是膽汁淤積型肝損傷。膽汁淤積是多種原因?qū)е碌哪懼?、分泌及轉(zhuǎn)運障礙，而鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP)、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽( organic anion transporting polypeptide，OATP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug-associated protein 2，MRP2)、BSEP等轉(zhuǎn)運體在膽汁酸的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，RFP能抑制Oatp2的攝取[13]；也能抑制Mrp2的功能，從而減少膽紅素和膽汁酸的轉(zhuǎn)運[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，RFP能夠抑制BSEP的轉(zhuǎn)運能力，這可能是RFP導(dǎo)致膽汁淤積的原因之一。此外，中藥療效穩(wěn)定、副作用較小，常與西藥聯(lián)合用藥降低西藥的毒副作用。目前常用的保肝藥物較多，如姜黃、三七、冬蟲夏草等。丹參也是重要的保肝藥物，其主要有效成分是TAN ⅡA，臨床上將TAN ⅡA磺酸鈉和還原性谷胱甘肽聯(lián)合使用治療膽汁淤積型藥物性肝炎，TAN ⅡA磺酸鈉通過誘導(dǎo)CYP450的活性，加速肝毒性物質(zhì)代謝，減少肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，TAN ⅡA能夠逆轉(zhuǎn)RFP對BSEP轉(zhuǎn)運能力的抑制作用，表明TAN ⅡA可能通過增強BSEP的功能，加速膽汁排泄，從而減緩膽汁淤積。

綜上所述，本文主要研究了RFP和TAN ⅡA對BSEP轉(zhuǎn)運能力的影響，結(jié)果表明，RFP能夠抑制BSEP的轉(zhuǎn)運能力，TAN ⅡA與RFP聯(lián)用后，BSEP的轉(zhuǎn)運能力上調(diào)。本研究進一步闡明了RFP誘導(dǎo)膽汁淤積的分子機制，為臨床治療RFP誘導(dǎo)的膽汁淤積提供了新的靶點，同時為TAN ⅡA用于預(yù)防RFP所致的膽汁淤積提供了依據(jù)。