新視角重探小鼠膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)與炎癥模型

吳相枝，徐銘枝，張東偉，付 潔，王 伊，宋海峰

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，特殊環(huán)境組學(xué)研究室，蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206)

小膠質(zhì)細(xì)胞是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的固有免疫細(xì)胞，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)總細(xì)胞數(shù)的10%～12%，在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)損傷中起到重要作用[1-2]。一方面，它起到免疫監(jiān)視和趨化作用，構(gòu)成CNS特有的免疫系統(tǒng)[3]。另一方面，多種CNS疾病都與非正常激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)，包括腦卒中、阿爾茨海默癥、帕金森病等[4]。

原代與永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用工具。從數(shù)量、均一性、獲得的難易程度等考慮，永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞優(yōu)于原代細(xì)胞，但永生化細(xì)胞在連續(xù)的傳代培養(yǎng)中，可能失去某些重要的特征和功能[5-6]。因此，原代膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)相關(guān)性更好，更貼近體內(nèi)真實(shí)情況[7]。故原代膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)在相關(guān)疾病機(jī)制研究以及新藥研發(fā)中具有不可替代的作用[7]。膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型是CNS藥理學(xué)研究的重要體外模型，對(duì)CNS相關(guān)疾病的新藥發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要[7-8]。自初次獲得原代小膠質(zhì)細(xì)胞以來，其提純與培養(yǎng)技術(shù)早已成熟固化[5]。雖然D-型多聚賴氨酸(poly-D-lysine，PDL)存在細(xì)胞毒性問題，但在膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中仍廣泛使用[5-11]。近年來，在細(xì)胞外基質(zhì)包被技術(shù)[12-13]、炎癥因子定量檢測(cè)技術(shù)[14]、細(xì)胞共培養(yǎng)與協(xié)同性研究技術(shù)等方面，都有了新的突破[15]。在新材料、新技術(shù)得到廣泛應(yīng)用的背景下，我們有必要重新審視固化多年的原代膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)[11-16]。本研究將新型包被材料(Matrigel、膠原蛋白)與傳統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞包被材料(PDL)進(jìn)行比較，并利用多因子檢測(cè)技術(shù)對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)行全面的定量評(píng)價(jià)。分析了多種影響原代膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型的因素，從多個(gè)新的角度為未來中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞炎癥模型的建立提供指引，并提出了優(yōu)化后的技術(shù)建議。

1 材料

1.1 試劑胎牛血清、高糖DMEM、胰酶、Hank′s緩沖液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、抗生素(美國Gibco公司)；PDL溶液(碧云天, C0312)；I型膠原蛋白 (collagen I, Solarbio公司, C8062)；Matrigel (美國Coring, 356234)；RNA提取試劑盒(德國QIAGEN, 74106)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Bio-Rad, 1708891)；qPCR熒光染料 (諾維贊, Q321-03)；ICC用抗Iba1抗體(日本W(wǎng)ako, 019-19741)；抗GFAP(ab4674)抗體、雞IgY、polyclonal-Isotype Control(ab37382)、抗Tuj1抗體(ab18207)、兔IgG、polyclonal-Isotype Control(ab171870)、抗Iba1抗體[1022-5](FITC) (ab15691)、小鼠IgG2b[PLPV219](FITC)-Isotype Control(ab91368)，均購自英國Abcam公司；Alexa Fluor?488 AffiniPure羊抗兔IgG(H+L)(翊圣生物, 33106ES60)；Alexa Fluor?647 AffiniPure羊抗雞IgY(IgG)(H+L)(美國Jackson, 103605155)；熒光法吞噬檢測(cè)試劑盒(美國AAT-Biolite)。

1.2 儀器細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)；qPCR儀(美國Bio-Rad)；體視鏡(北京福凱儀器有限公司)；倒置顯微鏡 (日本Olympus)；流式細(xì)胞儀(美國BD)；Incucyte S3活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像與分析系統(tǒng)(美國Essen BioScience)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生24 h內(nèi)的C57BL/6J乳鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司生產(chǎn)[SCXK (京)2016-0006]，不區(qū)分♀♂。

2 方法

2.1 培養(yǎng)材料表面處理用PBS稀釋PDL溶液至終濃度為0.1 g·L-1，包被24孔板和75 cm2培養(yǎng)瓶，室溫靜置15 min。使用前，PBS清洗2次。Matrigel、I型膠原蛋白包被方式按說明書使用。

2.2 細(xì)胞懸液制備及培養(yǎng)新生24 h內(nèi)的C57BL/6J小鼠乳鼠CO2吸入處死后，取下頭部置于Hank′s緩沖液中，在體視鏡下去除腦膜，僅保留雙側(cè)大腦半球。去膜后的腦放入含0.1% BSA DMEM培養(yǎng)基中；1 500 r·min-1離心5 min；加入培養(yǎng)基將組織吹碎，用70 μm細(xì)胞篩過濾后，再次離心。重懸后的細(xì)胞接種至PDL包被、未包被的75 cm2培養(yǎng)瓶，以及PDL包被的60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。并取出部分留樣(d 0)。

2.3 混合膠質(zhì)細(xì)胞的制備培養(yǎng)皿中細(xì)胞分別培養(yǎng)2、4、7 d。75 cm2培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，培養(yǎng)9 d和14 d，用0.05%胰酶消化8 min，收集細(xì)胞，離心獲得混合膠質(zhì)細(xì)胞沉淀。

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞的制備利用美天旎CD11b磁珠分選混合膠質(zhì)細(xì)胞，獲得CD11b陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)9 d的混合膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞，分別接種至PDL包被和未包被的24孔板中培養(yǎng)過夜，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的LPS(10、100、1 000 μg·L-1)處理48 h。提取培養(yǎng)0、2、4、6、7 d的混合細(xì)胞的總RNA及上述樣品的總RNA。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用染料法進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以管家基因RPL27為內(nèi)參，檢測(cè)混合膠質(zhì)細(xì)胞的Tuj1、NeuN、TREM2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和LPS刺激組樣品檢測(cè)IL-1α、IL-1β的mRNA水平。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Real-time PCR primer sequence

2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)小膠質(zhì)細(xì)胞接種至12孔板中培養(yǎng)過夜，加入4%多聚甲醛固定20 min；用PBS清洗2次，加入5%山羊血清封閉30 min；用PBS清洗2次，加入1 μL抗Iba1和0.5 μL抗GFAP抗體4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次，加入0.5 μL Alexa Fluor?488、1 μL Alexa Fluor?647標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；PBS清洗3次，加入DAPI室溫孵育10～15 min，倒置顯微鏡觀察。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)混合膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞利用80%甲醇固定5 min，0.1% Triton X-100處理20 min。分別加入GFAP、Tuj1、Iba1抗體，具體方法參照抗體說明書。流式細(xì)胞儀檢測(cè)混合細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞所占的比例。

2.8 吞噬試驗(yàn)原代小膠質(zhì)細(xì)胞接種至未包被的96孔板中培養(yǎng)，對(duì)照組加入細(xì)胞松弛素D孵育30 min，隨后與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞同時(shí)加入pH熒光探針Protonex×600 Red-Latex Beads Conjugate孵育4 h。利用Incucyte每隔20 min拍照1次，記錄熒光強(qiáng)度的變化，并將熒光強(qiáng)度均值與時(shí)間做歸一化處理。

2.9 液相芯片多因子檢測(cè)將混合膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)應(yīng)接種至未包被、PDL包被、Matrigel包被以及I型膠原蛋白包被的24孔板中，無血清培養(yǎng)過夜后，加入100 μg·L-1LPS處理48 h，收集細(xì)胞上清，通過上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行多因子檢測(cè)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 6軟件分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性采用Fisher檢驗(yàn)，方差不齊則采用T檢驗(yàn)法。

3 結(jié)果

3.1 膠質(zhì)細(xì)胞表征

3.1.1qPCR表征混合細(xì)胞中各類細(xì)胞特征性標(biāo)記物mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間的變化 混合細(xì)胞在培養(yǎng)0、2、4、6、7 d后，檢測(cè)各類細(xì)胞特征性標(biāo)記物mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。如Fig 1所示，在培養(yǎng)至d 2時(shí)，神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Tuj1、NEUN mRNA轉(zhuǎn)錄水平迅速降低，說明神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量迅速減少(Fig 1A)。而小膠質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)記物TREM2和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸升高，且GFAP mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升速度遠(yuǎn)高于TREM2。小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至d 6時(shí)，TREM2的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)31倍，趨于穩(wěn)定(Fig 1B)。

Fig 1 Relative transcription levels of GFAP, TREM2, Tuj1 and NEUN

Normalization by RPL27.

3.1.2免疫熒光表征小膠質(zhì)細(xì)胞純度 小膠質(zhì)細(xì)胞用多聚甲醛固定后，加入抗GFAP、Iba1兩種單克隆抗體、熒光染料DAPI進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，全部細(xì)胞均標(biāo)記上綠色熒光，鏡下未見紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞(Fig 2)。說明磁珠分選獲得了高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞。

Fig 2 Immunofluorescence staining of microglia obtained by magnetic bead sorting(×10)

Blue is DAPI-stained nuclei, green is Iba1-FITC-stained microglia, and red is GFAP-stained astrocytes.

3.1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)混合膠質(zhì)細(xì)胞中各細(xì)胞所占的比例 如Fig 3所示，星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+)占混合細(xì)胞的91.4%，神經(jīng)元細(xì)胞(Tuj1+)未檢出，小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1+)約占混合膠質(zhì)細(xì)胞的8.5%。

Fig 3 Flow cytometric analysis of GFAP(A), Tuj1(B), Iba1(C) expression and proportion on primary mix glial cells

The cells were stained with anti-GFAP, anti-Tuj1, anti-Iba1 and their isotype control.

3.1.4小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能檢測(cè) 每組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化如Fig 4所示，對(duì)照組熒光強(qiáng)度不隨時(shí)間延長而增加；實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)。說明獲得的原代小膠質(zhì)細(xì)胞保留了正常小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力。

Fig 4 Relationship between fluorescence intensity and time

Primary microglia were incubated with ProtonexTM600Red Beads for 4 h, fluorescence was processed by incucyte.

3.2 包被條件對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響

3.2.1mRNA水平初步探究包被條件對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響 為探究培養(yǎng)材料表面處理以及細(xì)胞間協(xié)同作用對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，將混合膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分別接種至未包被和PDL包被的培養(yǎng)材料中，加入含不同濃度LPS的培養(yǎng)液處理48 h，利用qPCR檢測(cè)IL-1α、IL-1β的mRNA變化情況。

3.2.1.1包被條件對(duì)混合膠質(zhì)細(xì)胞的影響 考察不同包被條件對(duì)混合膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響。如Fig 5所示，加入LPS(100 μg·L-1)處理時(shí)，未包被條件下IL-1α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)556倍，IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)12倍，均明顯低于PDL包被條件下這兩種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)不同濃度LPS處理的結(jié)果可看出，培養(yǎng)材料是否包被，對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)影響較大，在包被條件下，混合膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS更加敏感。

Fig 5 Transcription levels of inflammatory factor IL-1α and IL-1β mRNA after stimulation of mix glial by different concentrations of

**P<0.01vsuncoated condition

3.2.1.2包被條件對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響 如Fig 6所示，LPS(100 μg·L-1) 處理小膠質(zhì)細(xì)胞，未包被條件下，IL-1α上調(diào)58倍，IL-1β上調(diào)11倍；包被條件下IL-1α上調(diào)34倍，IL-1β上調(diào)5倍。1 000 μg·L-1處理時(shí)，亦是未包被條件下經(jīng)LPS刺激后，IL-1α和IL-1β轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于包被條件下的轉(zhuǎn)錄水平更高。綜上所述，未包被條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS更加敏感。

Fig 6 Transcription levels of inflammatory factor IL-1α and IL-1β mRNA after stimulation of microglial by different concentrations of

*P<0.05,**P<0.01vsuncoated condition

3.2.2深入探究包被條件對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響 根據(jù)qPCR結(jié)果，選用100 μg·L-1LPS處理在多種培養(yǎng)材料表面培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞48 h，并收集細(xì)胞上清，使用液相芯片檢測(cè)樣品中G-CSF、IL-1α，IL-1β等23種細(xì)胞因子的含量。混合膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果見Tab 2，小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果見Tab 3。

3.2.2.1包被條件對(duì)混合膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與生長的影響 混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在未包被、Matrigel包被、PDL包被、Ⅰ型膠原蛋白包被條件下的24孔板中，正常培養(yǎng)48 h，PDL包被和I型膠原蛋白包被條件下培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞無顯著形態(tài)差異，均與未包被條件下細(xì)胞形態(tài)類似(Fig 7A)。Matrigel包被條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞豐度明顯高于其他環(huán)境培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞(Fig 7B)。加入LPS處理后，未包被條件下，細(xì)胞形態(tài)如Fig 7C所示，Matrigel包被條件下細(xì)胞形態(tài)如Fig 7D所示，與正常培養(yǎng)條件下相比較，表層的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化。

3.2.2.2包被條件對(duì)混合膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響 在各種培養(yǎng)條件下，多因子檢測(cè)各炎癥因子濃度如Tab 3所示。可看出細(xì)胞因子TNF-α、G-CSF、IL-1α、MIP-IL-1β、RANTES的表達(dá)量在Matrigel包被條件下明顯高于其他條件下，約為其他條件下的1.5～4倍；KC的表達(dá)量在Matrigel包被條件下是其他條件的8.5～20倍。GM-CSF的表達(dá)量在PDL包被條件下相對(duì)較低，而在其他三種條件下的表達(dá)量則差異無顯著性。其他細(xì)胞因子在各種條件下表達(dá)量差異均無顯著性。

Tab 2 Detection of mixed glial protein expression under different

OO>:out of high limit of detection, OO<: below low limit of detection

Tab 3 Detection of microglia protein expression under different

3.2.2.3包被條件對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型評(píng)價(jià)的影響 用LPS處理未包被、Matrigel、PDL、I型膠原蛋白包被4種條件下的小膠質(zhì)細(xì)胞，多因子檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果如Tab 4所示。Matrigel包被條件下加入LPS刺激，各炎癥因子表達(dá)量均無明顯上升，而未包被條件下，加入LPS刺激后，各炎癥因子濃度明顯升高，且均高于PDL和I型膠原蛋白包被條件。說明小膠質(zhì)細(xì)胞在未包被條件下，對(duì)LPS的刺激更為敏感，與qPCR結(jié)果一致；PDL包被和I型膠原蛋白包被條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS的敏感性差異無顯著性，在Matrigel包被條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS基本不敏感。

Fig 7 Morphology of mixed glial cultured with different culture materials

A～B: Different materials cultured mixed glial without LPS treatment; C, D: Different materials culture mixed glial treated with 100 μg·L-1LPS for 48 h. A and C were cultured on uncoated material, B and D were cultured on Matrigel coated plate.

4 討論

混合膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)強(qiáng)度與廣度上均優(yōu)于提純后的小膠質(zhì)細(xì)胞?；旌夏z質(zhì)細(xì)胞中，小膠質(zhì)細(xì)胞的比例通常不會(huì)超過5%。因此，盡管多因子檢測(cè)結(jié)果中，小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子濃度更高，但考慮到細(xì)胞比例后，實(shí)際上混合膠質(zhì)細(xì)胞中的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子的能力更強(qiáng)。例如，未包被條件下，經(jīng)LPS(100 μg·L-1)處理后，105個(gè)混合膠質(zhì)細(xì)胞中，含有5×103個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞，IL-6的濃度為692.9±75.4 ng·L-1，而提純的小膠質(zhì)細(xì)胞在同等細(xì)胞數(shù)量時(shí)僅能產(chǎn)生465.6±130.4 ng·L-1的IL-6。說明星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅可貢獻(xiàn)如IL-6等炎癥因子，還通過細(xì)胞間協(xié)同作用向小膠質(zhì)細(xì)胞提供正反饋。

對(duì)多因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，可發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)特點(diǎn)：① Ⅰ型膠原蛋白與PDL包被材料培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，炎癥因子濃度與構(gòu)成基本一致，僅在小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中RANTES(CCL5) 的表達(dá)量相差10倍，其余因子濃度均在相同數(shù)量級(jí)。② 培養(yǎng)材料用Matrigel包被培養(yǎng)的細(xì)胞炎癥因子成分與比例較其它培養(yǎng)材料有較大不同，例如混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，Matrigel包被條件下的KC(CXCL1)分泌量達(dá)到其他條件下的15～20倍，其他指標(biāo)亦超過非Matrigel包被的數(shù)倍，但I(xiàn)L-12p40分泌量卻與其他環(huán)境接近。③ 將相同培養(yǎng)環(huán)境中小膠質(zhì)細(xì)胞與混合膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子分泌情況進(jìn)行比較。在有包被情況下，混合膠質(zhì)細(xì)胞的KC與MCP1(CCL2)分泌量均明顯高于小膠質(zhì)細(xì)胞，有的差異甚至達(dá)到多個(gè)數(shù)量級(jí)。這說明星形膠質(zhì)細(xì)胞亦參與了這兩種趨化因子的分泌。在未包被條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子分泌量則普遍較高。④ 混合膠質(zhì)細(xì)胞在PDL包被條件下，LPS刺激導(dǎo)致IL-1α與IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄量出現(xiàn)大幅提升，而其蛋白濃度提高卻不甚明顯。這提示了炎癥模型評(píng)價(jià)以蛋白濃度變化為準(zhǔn)的重要性。

用Matrigel包被的培養(yǎng)材料培養(yǎng)混合膠質(zhì)細(xì)胞，其表層可觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯高于其他材料培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞密度，且細(xì)胞狀態(tài)更佳。而且，LPS刺激Matrigel包被條件下培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞，表面的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與其在小鼠體內(nèi)的形態(tài)高度接近[16]，說明Matrigel包被培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞提供了接近體內(nèi)的生長環(huán)境。相反，因?yàn)樵贛atrigel包被的培養(yǎng)材料中，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS的敏感性顯著下降，因此，當(dāng)研究者需要使用提純的小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)避免使用Matrigel包被的培養(yǎng)材料。此時(shí)應(yīng)用未包被的材料培養(yǎng)，雖會(huì)犧牲一部分貼壁能力較差的細(xì)胞，卻能保證細(xì)胞對(duì)LPS等刺激因子具有高度的敏感性。

此外，根據(jù)本研究中qPCR與流式細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)，神經(jīng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)2 d后即凋亡消失[17]，相反，星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的比例逐漸增加。不同于傳統(tǒng)方法中混合培養(yǎng)21 d后再分離、收集細(xì)胞的策略。因此，在時(shí)間緊迫時(shí)，可提高起始動(dòng)物只數(shù)，從而可將實(shí)驗(yàn)周期縮短至7 d。

本研究通過將多種新材料和新技術(shù)應(yīng)用于小鼠膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)，比較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和新材料新技術(shù)的區(qū)別。通過本研究，可以得出以下結(jié)論：① 對(duì)于建立神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，應(yīng)使用混合膠質(zhì)細(xì)胞；② 使用Matrigel替代傳統(tǒng)的PDL作為培養(yǎng)材料的首選包被液，以達(dá)到最大程度模擬體內(nèi)環(huán)境、提高細(xì)胞活力的目的；③ 建立炎癥模型應(yīng)以蛋白水平炎癥因子檢測(cè)為主要指標(biāo)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所特殊環(huán)境組學(xué)研究室進(jìn)行，在此向所有幫助我的老師和同學(xué)表示由衷的感謝！)