高烏甲素通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制炎癥性疼痛

雷 寶，王生海，王正梅，宋延峰，杜彩霞，王 璐*

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.延安市中醫(yī)院麻醉科，陜西 延安 716000)

高烏甲素又名拉巴烏頭堿(lappaconitine)，是從毛茛科植物高烏頭的根中提取的一種生物堿。氫溴酸高烏甲素具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，另外還有抗炎消腫、降溫解熱與局部麻醉作用，鎮(zhèn)痛強(qiáng)度是氨基比林的7倍，與哌替啶的鎮(zhèn)痛效果相當(dāng)[1]。研究表明高烏甲素在甲醛溶液、鹿角菜膠致炎及佐劑性關(guān)節(jié)炎3種炎癥性疼痛模型中均有明顯的鎮(zhèn)痛作用[2]。然而，高烏甲素是對(duì)炎癥性疼痛的陣痛作用的機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研宄確切地證實(shí)了膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥和慢性痛中發(fā)揮重要的作用[3]。因此，本研究利用炎癥性疼痛模型，研究脊髓中膠質(zhì)細(xì)胞激活情況，進(jìn)一步闡明對(duì)高烏甲素對(duì)炎癥性疼痛的作用機(jī)制，為臨床用藥提供可靠的藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。于溫度(25.0±0.5℃)、相對(duì)濕度(50±5%)、明暗期(12/12h)的籠子里飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。大鼠給藥前禁食不禁水12 h。

1.2 試劑

高烏甲素購(gòu)于西安惠博生物科技有限公司。CFA(弗氏佐劑)購(gòu)于Sigma 公司，GFAP單克隆抗體(abcam公司)，OX-42單克隆抗體(abcam公司)。

1.3 模型制備、分組、取材

預(yù)處理組：?jiǎn)蝹?cè)(左側(cè))足底注射完全弗氏佐劑(CFA)前一天開始分別尾靜脈注射溶劑(生理鹽水)或高烏甲素溶液(低劑量組2 mg/kg，高劑量組10 mg/kg)，每天1次，連續(xù)5 d。分組：正常組，vehicle組，高烏甲素低劑量，高烏甲素高劑量組。取材部位：脊髓腰膨大L4-5段，取材前對(duì)大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，用生理鹽水經(jīng)心臟灌流沖凈血液。后處理組：?jiǎn)蝹?cè)(左側(cè))足底注射完全弗氏佐劑(CFA)后2 d，注射溶劑(生理鹽水)或高烏甲素溶液(低劑量組2 mg/kg，高劑量組10 mg/kg)，每天1次，連續(xù)5 d。分組同上。

1.4 行為學(xué)檢測(cè)

行為檢測(cè)前，各大鼠單獨(dú)放在測(cè)試架上的有機(jī)玻璃籠中室溫控制在25.0±0.5℃，適應(yīng)環(huán)境至安靜。

機(jī)械性刺激縮爪域值測(cè)定：按照Dixon等報(bào)道的方法[4]，測(cè)試環(huán)境為10×20×20 cm有機(jī)玻璃籠，釆用0.6～20 g的Von-Frey尼龍纖維，垂直刺激動(dòng)物后肢足掌中心部位。用一定強(qiáng)度的纖毛刺激，纖毛適度彎曲時(shí)計(jì)時(shí)，持續(xù)刺激時(shí)間為3 d，連續(xù)刺激5次，每次間隔5 s。纖毛刺激時(shí)，伴隨著動(dòng)物產(chǎn)生縮爪反應(yīng)，則為有效反應(yīng)(Positive respond)；而5次刺激反應(yīng)中，其中3次以上出現(xiàn)有效反應(yīng)，則認(rèn)為該纖毛的剌激強(qiáng)度為有效強(qiáng)度(Positive Intensity)反之，則為無(wú)效強(qiáng)度(Negative Intensity)。

熱痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)定：安靜環(huán)境中，將大鼠放入福射熱測(cè)痛儀的玻璃格子中，全身可以自由活動(dòng)。待大鼠靜置20 min后，用強(qiáng)光照射大鼠腳掌，測(cè)定大鼠的縮爪潛伏期(paw withdrawal latency ,PWL)，每間隔10 min測(cè)定一次，取三次測(cè)定結(jié)果的平均值作為測(cè)定結(jié)果。

1.5 免疫熒光染色

脊髓腰膨大L4-5段組織經(jīng)固定、脫水、包埋后，冰凍切片機(jī)連續(xù)切片(8 μm)。經(jīng)GFAP和OX-42單克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h后，于正置熒光顯微鏡照片。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取大鼠脊髓腰膨大L4-5段組織，按照Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，鑒定RNA的純度及完整性( A260/ A280范圍1.6～2.0，且凝膠電泳顯示18S和28S條清晰)。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作規(guī)程合成25 μL cDNA，PCR擴(kuò)增GFAP和OX-42基因片段。GFAP引物序列上游5’-TGGAGCTCAATGACCGCTTT-3’,下游5’-TCATCCGCCTCCTGTCTGTA-3’ (313 bp)；OX-42引物序列上游5’-ACCACTCATTGTGGGCAGCTC-3’,下游5’-CACCGGCTTCATTCATCATGTC- 3’ (629 bp)；內(nèi)參基因GAPDH上游5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’，下游5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’ (195 bp)。結(jié)果分析采用2δδCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western blot檢測(cè)大鼠脊髓組織GFAP和OX-42的蛋白表達(dá)

提取脊髓腰膨大L4-5段組織總蛋白，SDS-PAGE法電泳后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)封閉液封閉加入稀釋的一抗(1∶1000稀釋)，4℃下孵育過(guò)夜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000稀釋)，室溫下孵育2 h后。利用ECL顯色劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)，分析目標(biāo)條帶的灰度值異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高烏甲素對(duì)CFA誘導(dǎo)的大鼠疼痛的影響

各處理組每天藥物注射后3 h，6 h，24 h檢測(cè)機(jī)械痛敏(見圖1D,E,F)和熱痛敏行為(見圖1A,B,C)，末次藥物注射24 h后檢測(cè)對(duì)應(yīng)的機(jī)械痛敏和熱痛敏行為。結(jié)果顯示，高烏甲素低劑量(2 mg/kg)和高劑量(10 mg/kg)均不會(huì)影響SD大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛敏行為(見圖1A,D)。和vehicle組比較，高烏甲素低劑量(2 mg/kg)和高劑量(10 mg/kg)組均能緩解SD大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛敏行為(見圖1，B,C,E,F)。

2.2 免疫熒光染色檢測(cè)脊髓中GFAP和OX-42表達(dá)

脊髓腰膨大L4-5段免疫熒光結(jié)果顯示(見圖2)。與正常組比較，溶劑組中GFAP和OX-42的表達(dá)量明顯提高；高烏甲素給藥組中OX-42的表達(dá)量比低于溶劑組，然而溶劑組和高烏甲素給藥組中GFAP表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。

圖1 高烏甲素對(duì)CFA誘導(dǎo)的大鼠疼痛的影響A,B,C為熱痛敏值，D,E,F為機(jī)械痛敏值。A,D不注射CFA；B,E為預(yù)處理組；C,F為后處理組

圖2 免疫熒光染色檢測(cè)脊髓中GFAP和OX-42表達(dá)A.正常組GFAP熒光圖。B.溶劑組GFAP熒光圖。C.高烏甲素高劑量組GFAP熒光圖。D.正常組OX-42熒光圖。E.溶劑組OX-42熒光圖。F.高烏甲素高劑量組OX-42熒光圖

2.3 高烏甲素對(duì)CFA誘導(dǎo)大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42轉(zhuǎn)錄水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠脊髓腰膨大L4-5段組織中GFAP和OX-42基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化(見圖3A,B)。結(jié)果顯示，和正常組比較，vehicle組(生理鹽水)中GFAP和OX-42基因在轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高(P<0.05)。溶劑組比較，高烏甲素組中GFAP基因在轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異(P>0.05)；然而，高烏甲素高劑量組中OX-42基因在轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 高烏甲素對(duì)CFA誘導(dǎo)的大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42轉(zhuǎn)錄水平的影響

注：A.GFAP mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B.OX-42 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。和正常組比較，*P<0.05,***P<0.001 ；和vehicle組比較，++P<0.01

2.4 高烏甲素多CFA誘導(dǎo)大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42蛋白的影響

Western blot法檢測(cè)GFAP和OX-42蛋白的變化(見圖4，A,B)。結(jié)果顯示，和正常組比較，vehicle組(生理鹽水)中GFAP和OX-42蛋白均顯著升高(P<0.05)。溶劑組比較，高烏甲素組中GFAP蛋白無(wú)明顯差異(P>0.05)；然而，高烏甲素高劑量組中OX-42蛋白顯著降低(P<0.05)。

圖4 高烏甲素對(duì)CFA誘導(dǎo)的大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42翻譯水平的影響

注：A.GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量；B.OX-42蛋白的相對(duì)表達(dá)量。和正常組比較，*P<0.05,**P<0.01；和vehicle組比較，+P<0.05

3 討論

疼痛是一種不愉快的主觀感覺(jué)和體驗(yàn)，是臨床最常見的癥狀之一。慢性痛也稱病理性疼痛，在臨床上表現(xiàn)為對(duì)傷害性剌激敏感性增強(qiáng)和反應(yīng)閾值降低的痛覺(jué)過(guò)敏。炎癥性疼痛是慢性痛的一種，是由創(chuàng)傷、細(xì)菌或病毒感染、化學(xué)物質(zhì)以及外科手術(shù)等引起的外周組織損傷導(dǎo)致的炎癥引起的疼痛。本研究表明，針對(duì)CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛模型大鼠中，高烏甲素前處理組和后處理組均有明顯的疼痛效果(見圖1，B,C,E,F)，與劉銘佩[2]的研究結(jié)果基本一致。本研究首次采用高烏甲素預(yù)處理給藥方法，并且結(jié)果顯示在預(yù)處理組中，注射CFA后24 h顯示出明顯陣痛效果(見圖1，B)；然而，在后處理組中，48 h后才能觀察到陣痛效果(見圖1，C)，提示高烏甲素預(yù)處理給藥方法有更好的陣痛效果。

本研究結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法均顯示vehicle組脊髓腰膨大L4-5段組織中OX-42和GFAP基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均較正常組顯著升高(P<0.05)，且免疫熒光染色結(jié)果表明OX-42和GFAP表達(dá)數(shù)量顯著增加。膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，釋放多種因子，如促炎的細(xì)胞因子、趨化因子、反應(yīng)性氧簇等，參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生，直接誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生[5-7]。提示CFA刺激后的炎癥疼痛模型能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致疼痛的發(fā)生。在高烏甲素給藥組脊髓組織中，與vehicle組比較，GFAP基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均無(wú)顯著變化(P>0.05)；然而，OX-42基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，同時(shí)脊髓腰膨大L4-5段OX-42表達(dá)數(shù)量明顯減少(P<0.05)。表明高烏甲素能抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，但不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，暗示高烏甲素對(duì)炎癥性疼痛的陣痛作用可能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少參與炎癥反應(yīng)的促炎因子，趨化因子等成分的釋放，最終抑制疼痛的發(fā)生。