NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

張光輝，嚴(yán)小敏，邵小燕，魏士鈞

(重慶國(guó)聯(lián)干細(xì)胞技術(shù)有限公司，重慶 401325)

據(jù)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的2017年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年新發(fā)癌癥病例達(dá)429萬(wàn)，占全球新發(fā)病例的20%，死亡281萬(wàn)例[1]。自然殺傷(Natural killer，NK)細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤的、抗感染的第一道防線，對(duì)腫瘤和病毒的識(shí)別和殺傷無(wú)組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)限制、不依賴于抗體[2]，因此在腫瘤的免疫治療領(lǐng)域有較好的發(fā)展前景。筆者就NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 NK細(xì)胞概述

1.1 NK細(xì)胞的概念

NK細(xì)胞是具有多種免疫學(xué)功能的淋巴樣細(xì)胞，約占外周血淋巴細(xì)胞的10%～15%。人的NK細(xì)胞一般指CD3-CD56+淋巴細(xì)胞，根據(jù)CD56在NK細(xì)胞表面表達(dá)密度的差異，可將NK細(xì)胞分為CD56dim和CD56bright兩個(gè)亞群[3]。CD56dim亞群主要存在于外周血和脾臟中，可以通過(guò)表達(dá)穿孔素的方式來(lái)殺傷腫瘤，CD56bright亞群主要存在于淋巴結(jié)、扁桃體中，可以分泌干擾素γ、白細(xì)胞介素(IL)12、15、18等細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫功能[4]。

NK細(xì)胞的生成發(fā)育機(jī)制目前仍無(wú)定論，較統(tǒng)一的觀點(diǎn)是：NK細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞，由CD34+造血祖細(xì)胞(HPC)分化而來(lái)。IL-2、IL-15在NK細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可以在無(wú)其他細(xì)胞因子存在下誘導(dǎo)HPC分化為NK細(xì)胞。NK細(xì)胞在分化過(guò)程中根據(jù)階段的不同被分成了CD56dim和CD56bright兩個(gè)不同亞群，兩個(gè)亞群在人體免疫系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用[5]。

1.2 NK細(xì)胞的特性

NK細(xì)胞形態(tài)與T細(xì)胞和B細(xì)胞不同，其體積較大，屬于大顆粒淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別無(wú)MHC限制性，不依賴于抗體，無(wú)需致敏就可以發(fā)揮殺傷腫瘤和病毒的功能[6]。NK細(xì)胞表面具有MHC-I的抑制性特異性受體，可以與自體細(xì)胞表面的MHC-I結(jié)合以避免對(duì)其殺傷，而腫瘤細(xì)胞、病毒、衰老型細(xì)胞等常出現(xiàn)該信號(hào)的降低或缺損，因此NK細(xì)胞可發(fā)揮對(duì)該類細(xì)胞的殺傷作用[7]。NK細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如穿孔素、細(xì)胞毒因子、TNF、IFN-γ、IL-2等來(lái)發(fā)揮免疫監(jiān)視功能。NK細(xì)胞有多種受體及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子參與執(zhí)行效應(yīng)功能，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細(xì)胞的作用[8]。另外，NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用出現(xiàn)早，在體外1 h、體內(nèi)4 h即可見(jiàn)到殺傷效應(yīng)。因此，NK細(xì)胞也被稱為人體固有免疫系統(tǒng)的第一道防線。

2 NK細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制

NK細(xì)胞具有較廣的抗瘤譜，NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的機(jī)制為：①釋放穿孔素和顆粒酶引起靶細(xì)胞壞死或凋亡。NK細(xì)胞在體內(nèi)接觸到腫瘤細(xì)胞之后，通過(guò)胞吐將含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放，穿孔素通過(guò)聚合作用在靶細(xì)胞表面形成小孔，釋放的顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞，可通過(guò)多種不同途徑激起細(xì)胞的死亡，如激起caspases的鏈鎖反應(yīng)，引起靶細(xì)胞DNA降解活動(dòng)，然后裂解致使腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。②死亡受體作用途徑?；罨蟮腘K細(xì)胞可以表達(dá)TNF家族的成員配體，如FasL和TRAIL等，通過(guò)對(duì)腫瘤靶細(xì)胞表面因子的相關(guān)受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。其他成員配體也對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用[10]。③NK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子。NK細(xì)胞可分泌多種效應(yīng)性因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-5、IL-10、IL-13、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并殺傷腫瘤細(xì)胞[11]。④抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。NK細(xì)胞通過(guò)表面受體CD16與靶細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)殺傷靶細(xì)胞。并且，NK細(xì)胞自身所分泌的多種因子可以使其殺傷靶細(xì)胞的能力變強(qiáng)[12]。

3 NK細(xì)胞在腫瘤治療中的應(yīng)用

3.1 NK細(xì)胞擴(kuò)增

NK細(xì)胞是否能夠在腫瘤治療中發(fā)揮作用，最大的關(guān)鍵在于細(xì)胞的數(shù)量和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程大致為：采集供者外周血，分離獲取單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增。整個(gè)培養(yǎng)周期約10～23 d，常用的誘導(dǎo)因子主要有IL-2CD3、IL-15、IL-21等。NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率在200～1000倍，純度達(dá)60%～90%[13]。有數(shù)據(jù)顯示，NK細(xì)胞凍存后復(fù)蘇不會(huì)影響細(xì)胞的表型，也不會(huì)對(duì)細(xì)胞的殺傷能力產(chǎn)生明顯的影響。因此，前期將擴(kuò)增后的細(xì)胞進(jìn)行凍存，可有效解決細(xì)胞使用時(shí)的不確定性，便于臨床應(yīng)用[14]。

另外，也有使用臍帶血、細(xì)胞株、人胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等來(lái)培養(yǎng)NK細(xì)胞。培養(yǎng)方法上，使用經(jīng)輻照的滋養(yǎng)層細(xì)胞刺激活化PBMC來(lái)提高NK擴(kuò)增數(shù)量和細(xì)胞純度。但這些方法都帶入了異體的基因，在安全性上還需要更多的數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。

3.2 自體NK的免疫治療

1985年，Rosenberg最早使用NK細(xì)胞聯(lián)合IL-2進(jìn)行腎癌、黑色素瘤的治療，有效率為20%～30%，但大劑量的IL-2會(huì)引起較大的副作用[15]。目前，經(jīng)過(guò)對(duì)NK細(xì)胞培養(yǎng)方法的不斷改進(jìn)，在安全性上得到了提高，細(xì)胞毒性也隨之增強(qiáng)。臨床研究方面，Leivas A等[16]使用自體NK細(xì)胞治療了5例復(fù)發(fā)或難治性骨髓瘤患者，4名患者顯示疾病穩(wěn)定，其中2名患者骨髓浸潤(rùn)減少50%，并且多次輸注的耐受良好，輸注是安全有效的。Tong AA等[17]使用NK細(xì)胞治療移性或復(fù)發(fā)性尤文氏肉瘤，認(rèn)為NK細(xì)胞顯著降低了肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)原發(fā)性腫瘤有一定的限制作用。杜波等[18]對(duì)86例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行了NK細(xì)胞治療，結(jié)果顯示患者的免疫功能指標(biāo)均有所提高，肝功能指標(biāo)有所改善，預(yù)后良好，1年生存率為88.37%。李紅梅等[19]選取了復(fù)發(fā)性卵巢癌患者60例，患者NK細(xì)胞治療后腫瘤壞死因子-α、γ-干擾素、白細(xì)胞介素-2細(xì)胞因子顯著高于未給予NK細(xì)胞治療者，并且患者免疫功能指標(biāo)均顯著升高。

目前，使用自體NK細(xì)胞來(lái)治療腫瘤，使部分患者得到緩解，血液免疫性指標(biāo)有所提升，部分腫瘤進(jìn)展得到限制，預(yù)后良好，生活質(zhì)量也獲改善?？傮w來(lái)說(shuō)，自體NK輸注對(duì)部分患者的腫瘤治療有一定的治療效果，但是臨床也有部分患者效果不明顯，可能有以下原因影響療效：①部分腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)MHC，造成該腫瘤細(xì)胞發(fā)生逃逸，無(wú)法發(fā)揮NK細(xì)胞的殺傷作用。②部分腫瘤患者體內(nèi)的免疫功能本身存在缺陷，導(dǎo)致自體培養(yǎng)擴(kuò)增的NK細(xì)胞功能不強(qiáng)，不能達(dá)到殺傷腫瘤的效果。

3.3 異體NK的免疫治療

鑒于腫瘤患者自身的NK細(xì)胞存在擴(kuò)增的難度，擴(kuò)增成功也可能存在細(xì)胞毒性及功能不強(qiáng)的缺點(diǎn)，因此許多學(xué)者試圖通過(guò)異體NK細(xì)胞來(lái)應(yīng)用于腫瘤的免疫治療。異體細(xì)胞來(lái)源主要是同源異體的健康人群細(xì)胞、建立符合臨床治療要求的細(xì)胞系等來(lái)實(shí)現(xiàn)。

Yang Y等[20]使用同種異體NK細(xì)胞治療晚期淋巴瘤和晚期實(shí)體瘤，觀察到使用3×107細(xì)胞/kg分三次輸注是可耐受的，未出現(xiàn)顯著不良反應(yīng)，47.1%的患者病情穩(wěn)定，而且NK細(xì)胞在維持宿主免疫應(yīng)答的效應(yīng)方面也表現(xiàn)出有效性。Curti等[21]入組了經(jīng)化療后完全緩解的急性髓性白血病(AML)患者，后回輸同種異體半相合的NK細(xì)胞進(jìn)行治療，認(rèn)為可以提高患者的預(yù)后效果和生活質(zhì)量。Liang S等[22]對(duì)使用自體NK和異體NK細(xì)胞治療復(fù)發(fā)性乳腺癌的患者進(jìn)行了對(duì)比，認(rèn)為異體NK細(xì)胞治療患者在臨床療效、生活質(zhì)量、免疫功能、循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平等相關(guān)指標(biāo)提高方面優(yōu)于自體NK。

目前，異體NK細(xì)胞主要是使用半相合的供者，有研究認(rèn)為健康供者的細(xì)胞所培養(yǎng)出的NK在功能上更強(qiáng)，療效更好。但是異體NK的使用也還存在很多未知的問(wèn)題，如異體NK回輸入患者體內(nèi)后的生存期，對(duì)患者自身的免疫系統(tǒng)影響如何，異體輸注的安全性、不良反應(yīng)等，還需要進(jìn)一步的臨床研究。

3.4 臍血來(lái)源NK的免疫治療

臍血來(lái)源的NK細(xì)胞也屬于異體NK的范疇。臨床上常將臍血作為醫(yī)療垃圾進(jìn)行處理，可以通過(guò)收集臍血進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取NK細(xì)胞來(lái)應(yīng)用于腫瘤的治療，以達(dá)到變廢為寶的目的。

Shah N等[23]使用人工抗原呈遞飼養(yǎng)細(xì)胞(aAPC)誘導(dǎo)臍血PBMC來(lái)擴(kuò)增NK細(xì)胞，經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)新鮮臍血培養(yǎng)NK細(xì)胞的平均增殖倍數(shù)為1848倍，凍存復(fù)蘇臍血的增殖倍數(shù)為2389倍，NK細(xì)胞純度>95%，CD3+細(xì)胞低于1%。HerreraL等[24]比較了兩種基質(zhì)細(xì)胞系OP9和M2-10B4誘導(dǎo)臍血PBMC擴(kuò)增NK細(xì)胞的潛力，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的NK細(xì)胞可以表達(dá)與正常人體相似水平的顆粒酶B和穿孔素，對(duì)K562靶細(xì)胞的脫粒和細(xì)胞毒活性都非常相似。認(rèn)為可以使用臍血擴(kuò)增大量的成熟和有功能的NK細(xì)胞來(lái)用于腫瘤的免疫治療。

3.5 CAR-NK的免疫治療

經(jīng)過(guò)二十多年的研究及發(fā)展，嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修飾T細(xì)胞的研究快速發(fā)展。2017年8月30日，美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了諾華集團(tuán)的CAR-T療法Kymriah，用于治療25歲以下人群的急性淋巴細(xì)胞白血病。隨后，KitePharma的CAR-T療法Yescarta上市，用于治療罹患特定類型的大B細(xì)胞淋巴瘤成人患者。國(guó)內(nèi)，已有多家公司向中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局提交CAR-T療法的臨床實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)并獲受理，這將推動(dòng)CAR-T療法在腫瘤治療中的進(jìn)一步發(fā)展。CAR-T細(xì)胞在臨床治療中也存在較多的難點(diǎn)，如細(xì)胞因子風(fēng)暴、脫靶效應(yīng)等，而且CAR-T細(xì)胞治療目前主要針對(duì)于血液系統(tǒng)疾病，對(duì)實(shí)體瘤的治療效果還在研究當(dāng)中。而NK細(xì)胞具有獨(dú)特的腫瘤識(shí)別及殺傷能力，被認(rèn)為可以通過(guò)嵌合抗原受體的修飾而發(fā)揮強(qiáng)大的殺瘤作用。目前，科學(xué)家已經(jīng)成功轉(zhuǎn)導(dǎo)人類原代NK細(xì)胞和NK-92細(xì)胞系，用于開(kāi)展針對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤的臨床前和臨床研究。PinzKG等[25]使用anti-CD4CAR-NK-92細(xì)胞來(lái)治療外周T細(xì)胞淋巴瘤，該細(xì)胞在體內(nèi)能有效地靶向殺傷KARPAS-299細(xì)胞，認(rèn)為CAR-NK細(xì)胞可以作為治療外周T細(xì)胞淋巴瘤和CD4+T細(xì)胞惡性腫瘤。ChenX等[26]使用EGFR-CAR改造的NK-92細(xì)胞和原代NK細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)顯示了對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB和MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)大殺傷作用，認(rèn)為經(jīng)改造的CAR-NK細(xì)胞是治療乳腺癌的潛在有效策略。GenBler S等[27]發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGFR/EGFRvIII雙重靶向修飾的CAR-NK細(xì)胞降低了免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)，表現(xiàn)出用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的過(guò)繼性免疫治療的潛力。Oelsner S等[28]通過(guò)慢病毒基因轉(zhuǎn)移工程改造NK-92細(xì)胞，以表達(dá)靶向CD19并含有人CD3，復(fù)合CD28-CD3ζ的嵌合抗原受體或CD137-CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，該細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞白血病和淋巴瘤細(xì)胞都具有強(qiáng)大的殺傷能力，認(rèn)為可作為治療B細(xì)胞惡性腫瘤的手段。

從目前的臨床研究來(lái)看，絕大多數(shù)接受CAR-NK治療的患者并沒(méi)有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生排斥，表現(xiàn)出較好的臨床安全性。另外，清除T細(xì)胞的異體NK細(xì)胞不會(huì)造成移植物抗宿主病(GVHD)，并且NK細(xì)胞擁有更短的生理周期，更有效的細(xì)胞溶解能力。相對(duì)于CAR-T，可能CAR-NK會(huì)擁有更好的發(fā)展前景。

4 結(jié)束語(yǔ)

近年來(lái)，NK細(xì)胞的體外大規(guī)模擴(kuò)增方法有了較大的進(jìn)展，細(xì)胞數(shù)量、表型、殺傷能力基本上能滿足臨床研究使用，這有利于進(jìn)一步推進(jìn)NK細(xì)胞在腫瘤治療的發(fā)展進(jìn)程。體外大規(guī)模擴(kuò)增需要嚴(yán)格的硬件及軟件管理，需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)完成制備及檢測(cè)，才能保證細(xì)胞在臨床研究中的安全性和有效性。另外，在生產(chǎn)制備過(guò)程中還應(yīng)避免引入外源基因，使用安全必要的制備原料，接觸細(xì)胞的相關(guān)器材需要進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)過(guò)程要對(duì)細(xì)胞的數(shù)量、表型、細(xì)胞殺傷能力、無(wú)菌、內(nèi)毒素、支原體等進(jìn)行檢驗(yàn)，相關(guān)的檢驗(yàn)方法有依據(jù)的應(yīng)按中國(guó)藥典進(jìn)行檢驗(yàn)，中國(guó)藥典方法不適宜細(xì)胞檢測(cè)或未收錄的應(yīng)進(jìn)行相關(guān)檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。綜上所述，只有在保證細(xì)胞的安全性和有效性，才能發(fā)揮細(xì)胞治療的強(qiáng)大功效，才能使NK細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的作用得到進(jìn)一步發(fā)展。