脫膠條件對鹽解絲素蛋白分子量的影響

董悅涵

摘要? ? 絲素蛋白分子量的大小是影響其應(yīng)用范圍及應(yīng)用價值的重要因素，控制其分子量對絲素蛋白產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要。本文采用堿脫膠法，以不同的脫膠溫度（100 ℃和80 ℃）制備2種脫膠蠶絲，以脫膠率來表征其脫膠程度，然后均用2種溶解溫度（60 ℃和75 ℃）和相同的溶解體系來溶解一定時間，觀察其溶解程度;對不同處理所得的絲素蛋白，采用SDS-PAGE4電泳方法觀察其分子量的分布情況，從而研究脫膠條件對鹽解絲素蛋白分子量的影響。結(jié)果表明，采用堿脫膠法，100 ℃脫膠蠶絲比80 ℃脫膠蠶絲的脫膠得率高;在相同的溶解液和溶解溫度下，100 ℃脫膠蠶絲溶解比80 ℃脫膠蠶絲快;相同條件的脫膠蠶絲在不同的溶解溫度下，溶解所得的絲素蛋白的分子量分布有所不同;而在相同溶解溫度下，不同的溶解時間對分子量分布的影響不大。

關(guān)鍵詞? ? 家蠶絲;脫膠;絲素蛋白;分子量

中圖分類號? ? TS141.8? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A? ? ? ? 文章編號? ?1007-5739（2019）06-0211-03

蠶絲是一種天然蛋白質(zhì)長絲，是傳統(tǒng)的服裝用纖維，由絲素及包覆在外的絲膠構(gòu)成。隨著相關(guān)學(xué)科的交叉和發(fā)展以及人們對蠶絲結(jié)構(gòu)與性能研究的不斷深入，絲素與絲膠因其蛋白特性和良好的生物相容性、可降解性而成為備受關(guān)注的功能材料，應(yīng)用領(lǐng)域也由傳統(tǒng)的紡織服裝拓展到食品、化妝品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-3]。這些研究的技術(shù)路線基本上都是將絲素（或絲膠）溶解（或降解）后制成某種成型物（例如粉體、膜材等）。因此，絲素與絲膠的分離成為相關(guān)研究中首先需要解決的問題。絲素與絲膠的分離原理是基于絲素不溶于水，而絲膠具有水溶性的特點，在一定作用條件下絲膠溶解，從絲素上脫除下來，從而達(dá)到分離的目的，這一過程稱為脫膠。常規(guī)的脫膠方法[4-6]，因所用的助劑不同，可分為酸脫膠、堿脫膠、酶脫膠、皂脫膠、高溫高壓脫膠及復(fù)合脫膠等，本文采用堿脫膠法。

由于絲素是高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，蛋白分子量的大小是影響其應(yīng)用范圍及應(yīng)用價值的重要因素。因此，控制分子質(zhì)量對絲素蛋白產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要[7-8]。本文采用SDS-PAGE電泳技術(shù)分析不同條件溶解體系制取的絲素蛋白的分子質(zhì)量，探討調(diào)控絲素蛋白分子質(zhì)量的方法。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

1.1.1? ? 材料。家蠶繭;透析袋（截留分子量8～14 kDa），由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.2? ? 試劑。脫膠及溶解所用試劑：無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇均為分析純。SDS-PAGE電泳所用試劑：丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、四甲基乙二胺、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘油、冰乙酸、甲醇、考馬斯亮藍(lán)、甘氨酸等;標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker（分子質(zhì)量在2～200 kDa，上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.1.3? ? 儀器與設(shè)備。移液槍、溫度計、離心管、AR2140（電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司）、HH-2（數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司）、DGG-9070A（電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海森信實驗儀器有限公司）、TG16-WS（高速離心機上海盧儀）、JY200C（電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2? ? 試驗方法

本文采用堿脫膠法，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)鑒定不同條件溶解體系的絲素蛋白分子量。

1.2.1? ? 蠶繭的脫膠。100 ℃脫膠蠶絲制備：取10 g蠶繭，5 g無水碳酸鈉，投入1 000 mL沸水中，水浴45 min，撈出脫膠蠶絲，用等量（1 L）的蒸餾水清洗3～4遍，擰干，蓬松放入干燥箱中風(fēng)干（45 ℃，過夜）。

80 ℃脫膠蠶絲制備：取10 g蠶繭，5 g無水碳酸鈉，1 000 mL水沸騰后冷卻至80 ℃再投入，水浴30 min，撈出脫膠蠶絲，用清水清洗3～4遍，再放原脫膠液中，水浴30 min，撈出，用蒸餾水清洗，擰干，蓬松放入干燥箱中風(fēng)干（45 ℃，過夜）。

1.2.2? ? 脫膠率的計算。計算公式如下：

D（%）=100×（W0-W）/W0

式中，D為脫膠率，W0、W分別為蠶繭脫膠前、后的干重。

干重的稱量條件：材料晾干后置于鼓風(fēng)干燥箱中，在105 ℃下干燥，取出放入干燥平皿中冷卻至室溫后稱量。每種脫膠方案重復(fù)3次，取3次試驗結(jié)果的平均值。

1.2.3? ? 絲素蛋白溶液物理現(xiàn)象的觀察。采用CaCl2-EtOH-H2O為溶解液[9-10]。在60 ℃溶解溫度下，5 g的100 ℃和80 ℃脫膠蠶絲，均置于盛有23 g 無水氯化鈣、23.8 mL無水乙醇及30 mL蒸餾水的錐形瓶中，溶解時間設(shè)置40、60、90 min 3個水平，觀察其物理現(xiàn)象并記錄。在75 ℃溶解溫度下，5 g的100 ℃和80 ℃脫膠蠶絲，均置于盛有23 g 無水氯化鈣、23.8 mL無水乙醇及30 mL蒸餾水的錐形瓶中，溶解時間設(shè)置40、60、90 min 3個水平，觀察其物理現(xiàn)象并記錄。絲素蛋白溶液物理現(xiàn)象觀察：將盛有已處理過的絲素蛋白溶液的玻璃容器，對光觀察其顏色，用溶液中是否含有顆粒狀來判斷其溶解程度。

將上述溶解后的液體，裝入透析袋中放置透析缸中進(jìn)行透析，透析3 d，每天換1次水，除去其中的鹽和乙醇，最后利用分離技術(shù)將絲素蛋白與雜質(zhì)分離，得到純化的絲素蛋白。

1.2.4? ? 絲素蛋白分子量檢測。采用SDS-PAGE凝膠電泳方法[11]檢測。配制15%分離膠和5%濃縮膠。取12 μL樣品蛋白溶液于EP管內(nèi)，加3 μL樣品緩沖液，加樣前在沸水中加熱3 min，再加入溴酚藍(lán)5 μL。采用JY-SCZ2+型直板電泳槽，每孔加樣量20 μL。用30 mA電流完成濃縮膠電泳過程，再把電流調(diào)至20 mA，完成分離膠電泳過程。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色，再用脫色液（冰乙酸100 mL、甲醇100 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL）進(jìn)行脫色。最后用掃描儀器拍膠。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不同處理溫度對蠶繭脫膠率的影響

從表1可看出，100 ℃脫膠蠶絲的脫膠率比80 ℃高。有文獻(xiàn)報道，脫膠率>30%說明蠶絲脫膠完全[4]。由此可見，在80 ℃溫度下進(jìn)行的脫膠并不完全，其中脫膠蠶絲還殘留部分絲膠。因此，應(yīng)根據(jù)不同的用途選擇不同的溫度和時間進(jìn)行脫膠。

2.2? ? 不同脫膠蠶絲在不同溫度溶解的物理現(xiàn)象

據(jù)文獻(xiàn)報道，絲素蛋白溶液是乳白色的，如果溶液呈淺黃色，說明其中的氨基酸被脫出來[4]。由表2可知，100 ℃下脫膠蠶絲就出現(xiàn)此現(xiàn)象，可能是由于脫膠溫度過高，導(dǎo)致蠶絲蛋白中的氨基酸脫出。因此，最后絲素蛋白溶液的顏色與脫膠的溫度和脫膠時間有關(guān)，與溶解溫度和溶解時間無關(guān);而溶解程度與溶解溫度、溶解時間有關(guān)。也可得出，100 ℃脫膠蠶絲的溶解液分子量要小于80 ℃脫膠蠶絲的溶解液的。

從表2可以看出，相同的100 ℃溫度下脫膠蠶絲在60 ℃水浴條件下的完全溶解時間為90 min，而80 ℃的脫膠蠶絲要在75 ℃水浴溫度下，需要60 min才能溶解完全。100 ℃脫膠蠶絲和80 ℃脫膠蠶絲在相同溶解溫度下，100 ℃脫膠蠶絲比80 ℃脫膠蠶絲溶解所用的時間短，其原因是80 ℃脫膠絲還有殘留絲膠，導(dǎo)致其所需溶解時間長和溶解溫度高。因此，可以得出100 ℃脫膠蠶絲最佳溶解溫度為60 ℃，時間為90 min;80 ℃脫膠蠶絲最佳溶解溫度為75 ℃，時間為60 min。

2.3? ? 不同條件溶解體系制取的絲素蛋白的分子量

采用SDS-PAGE凝膠電泳方法進(jìn)行檢測。圖1～4中顏色較深的表示蛋白質(zhì)聚集的較多，顏色較淺的表示蛋白質(zhì)聚集的少。由圖1可知，100 ℃脫膠蠶絲在75 ℃水浴下溶解，分子量在15～31 kDa之間，隨著時間變化，對分子量大小的影響可忽略。

由圖2可知，100 ℃脫膠蠶絲在60 ℃水浴下溶解，分子量在31～51 kDa之間，隨著時間變化，對分子量大小的影響可忽略。

由圖3可知，80 ℃脫膠蠶絲在60 ℃水浴下溶解，分子量在51～79 kDa之間，隨著時間變化，對分子量大小的影響可忽略。

由圖4可知，80 ℃脫膠蠶絲在75 ℃水浴下溶解，分子量在51 kDa處，隨著時間變化，對分子量大小的影響變化可忽略。

從圖1～4可以看出，脫膠蠶絲在不同的水浴溫度下溶解，對分子量有影響，不論水浴溫度高低，80 ℃脫膠蠶絲分子量比100 ℃脫膠蠶絲高;脫膠蠶絲在相同水浴溫度、不同溶解時間下溶解，對分子量的影響可忽略。

3? ? 結(jié)論與討論

本文探討了不同條件的脫膠蠶絲在脫膠時的優(yōu)化條件及不同處理對絲素蛋白分子量的影響。試驗結(jié)果表明，在采用堿脫膠法下，100 ℃脫膠蠶絲脫膠得率比80 ℃脫膠蠶絲高。而在相同的溶解液和相同的溶解溫度下，100 ℃脫膠蠶絲比80 ℃脫膠蠶絲溶解快。100 ℃脫膠蠶絲溶解后，絲素蛋白溶液的顏色為淺黃色，80 ℃脫膠蠶絲溶解后，絲素蛋白溶液的顏色為乳白色。采用SDS-PAGE凝膠電泳測分子量，得出相同條件的脫膠蠶絲在不同的溶解溫度下，對分子量有影響（溶解所得的絲素蛋白的分子量有所不同）;而相同的溶解溫度下，不同的溶解時間對分子量的影響不大。

由于時間和試驗條件有限，本研究只是進(jìn)行了初步試驗，還可在溶解液、溶解溫度梯度等方面進(jìn)一步研究。蛋白分子量的大小是影響其應(yīng)用范圍及應(yīng)用價值的重要因素，因而控制分子量對絲素蛋白產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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