菊科4種植物萃取物對核桃病原真菌的抑菌活性研究

馮小飛 王紫雯 熊建輝 劉桂芹 陳玉惠 馬建鵬

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南省曲靖市林業(yè)局，云南 曲靖 655000；3. 曲靖市面店坡聯(lián)營林場 云南 曲靖 655000；4. 大理州林業(yè)有害生物防治檢疫局，云南 大理671000)

核桃（Juglans regia），又稱胡桃，為胡桃科核桃屬植物，多年生落葉喬木，是國內(nèi)外廣泛栽培的堅果樹種之一[1]，因其營養(yǎng)價值和保健功效較高而被稱為“智力果”、“長壽果”[2-3]。我國是世界上主要的核桃種植、生產(chǎn)和消費國，其中云南省核桃栽培歷史悠久，品種豐富[4-5]。隨著核桃相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，種植規(guī)模日漸擴(kuò)大，集約化栽培，田地間侵染病原菌多、管理水平不到位等因素，導(dǎo)致了近些年云南核桃種植地區(qū)病害發(fā)生嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了核桃品質(zhì)和產(chǎn)量，極大的損害和降低了種植戶的收益[6-7]。菊科（Asteraceae）植物種類多，適應(yīng)性強，分布范圍廣[8-9]。其中千里光（Senecio scandens）、苦荬（Ixeris denticulata)等本土菊科植物在民間有著悠久藥用歷史，含有的萜類、黃酮、生物堿等多種化合物具有殺蟲、抑菌、細(xì)胞毒素等活性[10-11]，是一類具有應(yīng)用價值和開發(fā)潛力的植物源農(nóng)藥材料[12-13]。云南地區(qū)菊科植物資源豐富，加強對本土菊科植物利用的同時，也應(yīng)該關(guān)注外來入侵菊科植物的研究、利用和開發(fā)。小飛蓬（Conyza canadensis）、波斯菊（Cosmos bipinnata）等菊科外來入侵植物已經(jīng)對當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了一定的影響，通過本次實驗，開展菊科植物在核桃病原真菌抑菌活性方面的研究，發(fā)掘菊科植物在植物源抑菌藥物方面的潛能，同時促進(jìn)外來入侵菊科植物的

防治[14-15] 。

本研究以云南省多個核桃主要種植地區(qū)的病害調(diào)查結(jié)果為依據(jù)，對引起核桃枝枯的主要病原菌以及造成果實和葉部病害的病原菌開展抑菌活性研究。利用4種不同的菊科植物提取物為實驗材料，對5種病原真菌開展抑菌實驗，篩選出具有抑菌活性的菊科植物，為5種核桃病原菌的防治及植物抑菌農(nóng)藥的開發(fā)提供參考依據(jù)[16-17]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菊科植物材料來源

千里光、波斯菊、小飛蓬、苦荬采自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，選擇生長狀況良好的菊科4種植物地上部分，室內(nèi)陰干備用。

1.1.2 供試菌株來源

供試菌株為殼梭孢（Fusicoccum persicae）、殼二孢（Ascochytasp.）、擬莖點霉（Phomopsissp.）、膠孢炭疽（Colletotrichum gloeosporioides）、葉點霉（Phyllostictasp.），來源于西南林業(yè)大學(xué)，云南省高校森林有害生物科技創(chuàng)新團(tuán)隊前期從核桃樹上分離所得，現(xiàn)保存于西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.1.3 抑菌物質(zhì)的萃取

菊科4種植物陰干后剪成小段（長1～2 cm），每種樣品5 kg，用2倍體積的85%乙醇水溶液浸提3次，每次3 d。合并提取液，減壓蒸餾得到菊科4種植物粗提物的浸膏。不同浸膏用2倍質(zhì)量的蒸餾水溶解飽和后，分別用3倍體積的石油醚、乙酸乙酯對粗提物萃取3次，萃取后的有機試劑合并后經(jīng)減壓蒸餾濃縮后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 萃取物抑菌母液的配制

實驗采用抑菌培養(yǎng)基對5種核桃病原菌進(jìn)行抑菌活性研究，抑菌培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度分別為0.0、0.5、1.5、2.5、5.0 mg/mL。按照總體積150 mL的抑菌培養(yǎng)基計算，分別稱取一定質(zhì)量的千里光、波斯菊、小飛蓬、苦荬萃取物于25 mL小三角瓶中，用10 mL 85%的乙醇水溶液充分溶解，溶解后的萃取物抑菌溶液放入無菌臺中，紫外燈滅菌30 min后做為抑菌母液備用。

1.2.2 抑菌培養(yǎng)基的制備

滅菌后的PDA培養(yǎng)基在無菌臺中冷卻至50 ℃左右，將紫外滅菌后的萃取物液添加到PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿（直接9 cm），每皿20 mL，按照不同的濃度梯度配制成不同的抑菌培養(yǎng)基冷卻后備用，同時對照培養(yǎng)基中加入相同體積的85%乙醇水溶液，每個濃度3個平行實驗[18]。

1.2.3 抑菌實驗

采用生長速率法[19]測定不同濃度的菊科4種植物萃取物對5種核桃病原菌菌絲體生長的抑制作用。在無菌臺中將病原菌種制成菌碟（直徑0.5 cm）后接種到抑菌培養(yǎng)基質(zhì)的中央，以未添加抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基為CK進(jìn)行接種。接種后的培養(yǎng)皿至于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察5種核桃病原真菌在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況及菌絲體生長情況。通過十字交叉法[20]每2 d對不同病原菌菌絲體的生長速率進(jìn)行測量，待對照菌絲體長滿培養(yǎng)皿邊緣，結(jié)束測量試驗，并按公式（1）計算抑菌率（X）[21-22]。

式中，D1為CK菌落直徑，D2為處理組菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以SPSS 19軟件中Duncan方法對實驗結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析，同時進(jìn)行各組處理數(shù)據(jù)間的顯著性分析和比較。

以SPSS 19軟件開展毒力回歸方程的模擬和半抑制率（EC50）的計算。抑菌率、濃度、總數(shù)為變量，以軟件回歸分析中的Probit過程進(jìn)行10為對數(shù)底的logit模型轉(zhuǎn)換，計算出不同抑菌物質(zhì)的EC50值；參數(shù)估計值中的PROBIT模型即為不同抑菌物質(zhì)的毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度3種萃取物對核桃病源菌株的抑菌效果

由表1可知，菊科植物萃取物對供試的5株核桃病原真菌菌絲體生長都表現(xiàn)出了一定的抑制效果，隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強，且較高濃度（5.0 mg/mL）與低濃度（0.5 mg/mL）時對病原真菌的抑制效果差異顯著（P＜0.05）。不同菊科植物的石油醚萃取物對核桃病原菌的抑制效果不同，小飛蓬石油醚萃取物對殼梭孢、殼二孢、炭疽菌的抑制效果較好，最高抑制率分別達(dá)到了77.5%、81.6%、79.5%，與相同濃度的石油醚萃取物相比抑制率差異顯著（P＜0.05）。波斯菊萃取物對上述3種病原菌的抑制效果次之，相同濃度時的抑制率分別達(dá)到了66.1%、63.9%、70.5%，低于小飛蓬石油醚萃取物的抑制率，但是顯著高于苦荬和千里光萃取物（P＜0.05）。此外，波斯菊石油醚萃取物對擬莖點霉和葉點霉的抑制效果較好，最高抑制率分別達(dá)到了45.7%和74.1%，且抑制率差異顯著（P＜0.05）。4種植物的石油醚萃取物對擬莖點霉病原菌的抑制效果最弱，最大濃度時的抑制率均小于46%。乙酸乙酯萃取物對供試的5種核桃病原真菌也表現(xiàn)出了不同的抑制效果，千里光的乙酸乙酯萃取物對供試病原菌的抑制效果較好，特別是對殼梭孢、葉點霉和炭疽3種病原菌，最大抑制率分別為68.8%、60.3%、70.3%，相同濃度條件下差異顯著（P＜0.05）；小飛蓬乙酸乙酯萃取物對殼二孢和擬莖點霉的抑制效果較好，最大抑制率分別為59.1%、61.8%，高于其他菊科植物乙酸乙酯萃取物的抑制率，千里光萃取物的抑制效果次之，分別為54.6%、52.7%。

菊科4種植物的石油醚萃取物對5種供試核桃病原真菌的抑制效果總體較好，除了對擬莖點霉病原菌的抑制率較低，對其余4種病原菌的最大抑制率均超過了74%，最大達(dá)到了81.6%。乙酸乙酯萃取物對擬莖點霉病原菌抑制效果較好，最高抑制率達(dá)到了61.8%，相同條件下對對殼梭孢、殼二孢、葉點霉和炭疽病原菌的抑制效果均小于石油醚萃取物，最大抑制率為59%～70%。

表 1 菊科4種植物的萃取物對核桃病原真菌的抑制效果Table 1 Inhibition effect of extracts from 4 plant species of Asteraceae on J. regia pathogenic fungi

續(xù)表 1

2.2 不同萃取物對核桃病原真菌抑制率的毒力回歸方程

利用SPSS 19軟件對菊科4種植物對病原菌的抑制率進(jìn)行毒力回歸方程的模擬和建立[23]，同時結(jié)合卡方分布表，利用卡方檢驗對本次軟件模擬的毒力回歸方程進(jìn)行擬合優(yōu)度的檢驗，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，χ2值均小于檢驗的臨界值5.991（χ0.052）（自由度為2時），且P值均大于0.05，卡方（χ2）檢驗結(jié)果說明毒力回歸方程擬合優(yōu)度良好。

表 2 菊科4種植物的萃取物對核桃病原真菌毒力的回歸方程Table 2 Regression equation of the extracts from 4 plant species of Asteraceae on the virulence of J. regia pathogenic fungi

續(xù)表 2

2.3 不同萃取物對核桃病原菌的EC50值

EC50值表示抑制率達(dá)到50%時添加的抑菌物的質(zhì)量，EC50值的大小反應(yīng)了不同抑菌物對病原菌的抑制能力，抑菌能力越強，EC50值越小。

2.3.1 菊科4種植物石油醚萃取物對核桃病原菌EC50值的影響

由圖1～2可知，波斯菊的石油醚萃取物對5種病原菌的EC50值均較小，分別為0.63、1.72、6.78、0.56、0.05 mg/mL；苦荬石油醚萃取物對葉點霉EC50值為4.58 mg/mL，對其余4種病原菌的EC50值均大于12.0 mg/mL，最大達(dá)到了240.69 mg/mL；千里光石油醚萃取物對殼梭孢、殼二孢和葉點霉病原菌的EC50值均小于4.50 mg/mL，最小為1.42 mg/mL；小飛蓬石油醚萃取物對殼梭孢、殼二孢和炭疽菌的EC50值分別為1.31、1.34、0.71 mg/mL，對擬莖點霉和葉點霉的EC50值均大于13.0 mg/mL。

圖 1 石油醚萃取物對殼梭孢、殼二孢、炭疽菌的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effects of petroleum ether extracts on Fusicoccum persicae， Ascochyta sp.， and Colletotrichum gloeosporioides

圖 2 菊科4種植物石油醚萃取物對5種病原菌EC50值的影響Fig. 2 Effects of petroleum ether extracts from 4 plant species of Asteraceae on EC50 values of 5 pathogens

2.3.2 菊科4種植物乙酸乙酯萃取物對核桃病原菌抑菌活性的影響

由圖3可知，千里光的乙酸乙酯萃取物對5種病原菌的半抑制濃度均小于其他供試植物的EC50值，分別為0.26、2.05、3.96、1.95、0.68 mg/mL；波斯菊乙酸乙酯萃取物對殼二孢、葉點霉和炭疽菌的EC50值均小于4.5 mg/mL，對炭疽菌的EC50值最小達(dá)到了3.41 mg/mL；苦荬對炭疽菌的EC50值最小，為2.43 mg/mL，對其他4種病原菌的EC50值均超過了5.5 mg/mL，對殼二孢的半抑制率濃度最大，為38.9 mg/mL；小飛蓬乙酸乙酯萃取物對殼二孢、擬莖點霉和葉點霉的半抑制均較小，3種病原菌的EC50值都小于4.1 mg/mL，對炭疽菌的EC50值最大，為19.94 mg/mL。

圖 3 菊科4種植物乙酸乙酯萃取物對5種病原菌EC50值的影響Fig. 3 Effects of ethyl acetate extracts from 4 plant species of Asteraceae on EC50 values of 5 pathogens

3 結(jié)論與討論

實驗結(jié)果表明，菊科4種植物的萃取物對供試的5種核桃病原真菌菌絲體生長都有一定的抑制作用，抑制效果與菊科植物種類、萃取所用有機溶劑和添加的抑菌物濃度有關(guān)。小飛蓬石油醚萃取物對殼梭孢、殼二孢和炭疽菌菌絲體的生長表現(xiàn)出了較好的抑制活性，最大抑制率分別達(dá)到了77.5%、81.6%、79.5%，EC50值分別為1.31、1.34、0.71 mg/mL。波斯菊石油醚萃取物對葉點霉菌絲體生長抑制效果較好，最大抑制率達(dá)到了74.1%，半抑制率濃度為0.56 mg/mL。小飛蓬乙酸乙酯萃取物對擬莖點霉病原菌抑制效果較好，最大抑制率達(dá)到了61.8%，半抑制率濃度為3.63 mg/mL。石油醚萃取物對供試病原真菌的抑制效果普遍較好，特別是對殼梭孢、殼二孢、葉點霉和炭疽，抑制率顯著大于相同濃度的乙酸乙酯萃取物；除了對擬莖點霉外，乙酸乙酯萃取物對剩余病原菌的抑制效果均弱于相同條件下的石油醚萃取物，結(jié)合EC50值可知，不同萃取物對病原菌的抑制率大，其對應(yīng)的萃取物EC50值均較小。

傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥因殘留重，難降解，對環(huán)境污染大等問題越來越不適用于無公害果蔬的生產(chǎn)。近年來，隨著“安全農(nóng)藥”理念的提出，綠色、環(huán)保、高效、低毒的植物源農(nóng)藥成了研究和開發(fā)的熱點。小飛蓬是西南地區(qū)主要菊科外來入侵物種之一，本研究發(fā)現(xiàn)，小飛蓬的萃取物對殼梭孢、殼二孢、擬莖點霉、炭疽菌4種核桃病原真菌的菌絲體生長都表現(xiàn)出了較好的抑制活性，說明該植物中含有的1種或者幾種化合物對上述5種病原真菌的菌絲體生長造成一定的影響，阻礙其在培養(yǎng)基上的正常生長。本研究利用不同小飛蓬的萃取物對供試病原菌開展抑菌活性，因為萃取物中含有多個化合物，目前不能確定對病原菌的抑菌效果是植物體中單體化合物的獨立效果還是多個化合物對病原菌的協(xié)同作用。后期將利用小飛蓬為材料，針對殼梭孢、殼二孢、擬莖點霉、炭疽菌等病原菌開展活性追蹤，對抑菌效果較好的萃取物進(jìn)行活性單體化合物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定和抑菌試驗研究，進(jìn)一步確定活性化合物的結(jié)構(gòu)和種類，為菊科植物綠色抑菌農(nóng)藥的開發(fā)提供基礎(chǔ)[24]。