光遺傳學(xué)：一種行為光控新技術(shù)

郭曉強(qiáng)

北京大學(xué) 深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036

“假如給我三天光明——第一天，我要看人，他們的善良、溫厚與友誼使我的生活值得一過；第二天，我要在黎明起身，去看黑夜變?yōu)榘讜兊膭尤似孥E；第三天，我要在現(xiàn)實(shí)世界里，在從事日常生活的人們中間度過平凡的一天。”

——美國著名盲人女作家、社會活動家海倫?凱勒(Helen Keller)

光對生命具有舉足輕重的地位， 萬物生長靠太陽 。對大部分植物而言，它們借助光合作用合成營養(yǎng)物質(zhì)并釋放出氧氣，而動物則依靠這些營養(yǎng)物質(zhì)和氧來維持生存。此外，光還可以指導(dǎo)細(xì)菌和植物的向光性，控制植物生長和開花時間。對于人類和其他動物而言，借助光來觀察和感知這個 光明 世界。該過程由 眼睛 完成，稱為視覺。大部分視覺健康的人都可通過眼睛清晰地觀察到這個世界，看到周圍的花花草草和五光十色的世界。那么，我們是如何觀察到這些事物的呢？文藝復(fù)興后，人們對光的本質(zhì)進(jìn)行探索，從而對光的成像機(jī)制有了新認(rèn)識，自然對視覺形成機(jī)制也產(chǎn)生濃厚興趣。

1 視紫紅質(zhì)

視覺研究可追溯到18世紀(jì)。荷蘭科學(xué)家列文虎克(Antonie Philips van Leeuwenhoek)借助顯微鏡觀察眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，鑒定出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)、視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞等，并推測這些細(xì)胞與視覺形成相關(guān)。1851年，德國解剖學(xué)和生理學(xué)家繆勒(Heinrich Müller，1820ü1864)首次報(bào)道視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞顯紅色這一現(xiàn)象[1]。遺憾的是，繆勒錯誤地認(rèn)為紅色由血液造成。盡管如此，繆勒仍被看作視覺生理研究的先驅(qū)?？娎赵谝曈X生物學(xué)領(lǐng)域作出諸多貢獻(xiàn)，如首次描述視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這類細(xì)胞也因此獲名 繆勒細(xì)胞 。

博爾(Franz Boll，1849ü1879)是一位德國生理學(xué)家，對視覺形成具有濃厚興趣。1876年11月，博爾也觀察到紅色視桿細(xì)胞，并認(rèn)定紅色源于其含有一類特殊物質(zhì)，糾正了繆勒早期的錯誤。博爾還發(fā)現(xiàn)視桿細(xì)胞的紅色受光影響，光照可導(dǎo)致紅色褪去，而在暗處又重新恢復(fù)，進(jìn)一步說明紅色物質(zhì)與視覺形成相關(guān)。遺憾的是，博爾的早逝(年僅30歲)使研究沒有進(jìn)一步開展。

1877年1月，博爾的同胞、另一位德國著名生理學(xué)家屈內(nèi)(Wilhelm Friedrich Kühne，1837ü1900)進(jìn)一步糾正博爾的不足，認(rèn)定視網(wǎng)膜感光物質(zhì)應(yīng)為紫紅色，并創(chuàng)造 視紫紅質(zhì)(rhodopsin) 一詞。屈內(nèi)還取得另一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，即膽酸可使視桿細(xì)胞內(nèi)的視紫紅質(zhì)釋放到溶液里，并基于這一原理首次從牛視網(wǎng)膜完成視紫紅質(zhì)的純化[2]，屈內(nèi)也因此成為視覺生理領(lǐng)域的奠基人之一(圖1)。雖然已確定視紫紅質(zhì)參與視覺形成，但具體分子機(jī)制仍不清晰，直到20世紀(jì)30年代才有突破。

圖1 視紫紅質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

2 視黃醛循環(huán)

1931年，美國眼科專家尤德金(Arthur Yudkin，1892ü1957)開始對視網(wǎng)膜成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其含有一種維生素A樣物質(zhì)。其實(shí)，人們很早就知道維生素A缺乏可影響視覺形成，最常見的一種疾病叫夜盲癥，但對維生素A如何參與視覺卻知之甚少。

1932年，美國生理學(xué)家瓦爾德(George Wald，1906ü1997)來到德國瓦伯格(Otto Heinrich Warburg，1931年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)實(shí)驗(yàn)室開始全面研究視紫紅質(zhì)。瓦爾德首先借助光譜分析法證明青蛙、綿羊、牛等完整視網(wǎng)膜中存在維生素A，接著使用氯仿提純視紫紅質(zhì)，化學(xué)顯色反應(yīng)表明所含物質(zhì)與維生素A非常相似。為進(jìn)一步證實(shí)結(jié)論，瓦爾德加入瑞士著名科學(xué)家卡雷爾(Paul Karrer，1937年諾貝爾化學(xué)獎獲得者)的實(shí)驗(yàn)室，而卡雷爾分離并確定了維生素A的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過3個月研究，瓦爾德最終確定視紫紅質(zhì)中確實(shí)含有維生素A，從而表明視紫紅質(zhì)包含兩部分：視蛋白(opsin)和維生素A[3]。隨后，瓦爾德又加入德國海德堡邁耶霍夫(Otto Fritz Meyerhof，1922年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)開展視覺形成研究。一次偶然事件為研究帶來重大契機(jī)！當(dāng)時正逢假期，許多實(shí)驗(yàn)室人員都去度假，恰在此時運(yùn)抵300只青蛙。實(shí)驗(yàn)室助理原本想丟棄，而瓦爾德則主動要求留下來用作實(shí)驗(yàn)材料。瓦爾德從青蛙視網(wǎng)膜提取到足夠量的視紫紅質(zhì)，進(jìn)一步分析后驚奇地發(fā)現(xiàn)所含的維生素A與卡雷爾所得維生素A盡管大部分性質(zhì)相似，但仍有些許差異，因此將這種物質(zhì)重新命名為視網(wǎng)膜色素(retinene)。瓦爾德還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素與維生素A之間可發(fā)生轉(zhuǎn)變，并通過后來詳細(xì)的結(jié)構(gòu)分析確定了兩者間的差異，因此視網(wǎng)膜色素更名為視黃醛，而維生素A則稱為視黃醇[4]。

20世紀(jì)50年代，瓦爾德和同事經(jīng)過近20年探索，最終解析出視覺形成的 視黃醛循環(huán) 機(jī)制：靜息狀態(tài)下，視桿細(xì)胞內(nèi)視蛋白與11-順視黃醛結(jié)合形成視紫紅質(zhì)；光線照射可使11-順視黃醛發(fā)生異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)槿词揭朁S醛，從而與視蛋白分離，這個過程激活視蛋白，啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終到達(dá)大腦視覺中心；全反式視黃醛可被運(yùn)輸?shù)揭暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過幾步化學(xué)反應(yīng)重新生成11-順視黃醛；11-順視黃醛回到視桿細(xì)胞再次與視蛋白結(jié)合形成視紫紅質(zhì)，從而完成一次視覺感知過程(圖2)。瓦爾德的發(fā)現(xiàn)很好地詮釋了視黃醛參與視覺形成的機(jī)制，因此他分享了1967年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

圖2 瓦爾德與視黃醛循環(huán)

后續(xù)研究還揭示了視蛋白作用機(jī)制。視蛋白是一種G-蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)。光通過改變視黃醛結(jié)構(gòu)而激活視蛋白后，可進(jìn)一步使異三聚體G蛋白激活，從而使磷酸二脂酶活化，催化cGMP水解為5’-GMP而減少cGMP含量；細(xì)胞內(nèi)受cGMP調(diào)控的離子通道關(guān)閉，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位出現(xiàn)變化，最終傳導(dǎo)至視覺中心而實(shí)現(xiàn)光的感知。從這個過程可以看出，哺乳動物視紫紅質(zhì)的作用機(jī)制較為復(fù)雜，作為機(jī)體視覺感知過程尚可接受，如果將它們應(yīng)用到其他系統(tǒng)則困難重重，因此有必要尋找更簡單的感光系統(tǒng)[5]。

3 細(xì)菌感光

最初認(rèn)為只有高等動物才存在視覺系統(tǒng)，但這一觀念在20世紀(jì)60年代發(fā)生改變。1967年，德裔美國生理學(xué)家斯托克尼烏斯(Walther Stoeckenius，1921ü2013)成為加州大學(xué)舊金山分校的教授，重點(diǎn)研究生物膜(如紅細(xì)胞膜和線粒體膜)結(jié)構(gòu)[5]。由于生物膜材料獲取比較困難，具有電子顯微鏡背景的斯托克尼烏斯決定用生物化學(xué)方法研究鹽生鹽桿菌(Halobacterium halobium)細(xì)胞膜組成。隨后兩位新同事的到來壯大了實(shí)驗(yàn)室的力量。厄斯特黑爾特(Dieter Oesterhelt)是一位訓(xùn)練有素的德國化學(xué)家，跟隨呂南(Feodor Lynen，1964年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)獲得博士學(xué)位，由于學(xué)術(shù)休假的緣故來到美國；布勞羅克(Allen Blaurock)是一位剛畢業(yè)的英國生物物理學(xué)家，原來在國王學(xué)院威爾金斯(Maurice Wilkin，1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)實(shí)驗(yàn)室從事X射線衍射研究[6]。厄斯特黑爾特和布勞羅克借助X射線衍射技術(shù)觀測細(xì)菌細(xì)胞膜紫色組分時，意外觀察到一種清晰的衍射圖像，說明其含有一種高度有序的生物分子。厄斯特黑爾特還觀察到紫色物質(zhì)在添加有機(jī)溶劑后顏色變黃。此時，布勞羅克回憶起在國王學(xué)院研究青蛙視網(wǎng)膜過程中也觀察到類似的顏色變化，這一提示促使厄斯特黑爾特大膽假設(shè)該物質(zhì)可能也是視紫紅質(zhì)。為證實(shí)這一假說，首先需解答的問題是其含不含視黃醛。

從細(xì)菌中尋找視黃醛這一近乎瘋狂的想法促使厄斯特黑爾特立即啟動驗(yàn)證工作。借鑒青蛙視紫紅質(zhì)的研究方法，厄斯特黑爾特發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的紫色物質(zhì)具有類似的物理和化學(xué)性質(zhì)，并且還含有視黃醛?；谶@些特性，厄斯特黑爾特和斯托克尼烏斯于1971年確定這是一種新型視紫紅質(zhì)，根據(jù)來源將其命名為細(xì)菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin，BR)(圖3)[7]。

斯托克尼烏斯經(jīng)過進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌視紫紅質(zhì)是一種光依賴的離子通道。更大的突破在1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的亨德森(Richard Henderson，2017年諾貝爾化學(xué)獎獲得者)解析了細(xì)菌視紫紅質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，從而對視紫紅質(zhì)的作用有了更深入的認(rèn)識。1972年，重組DNA技術(shù)的發(fā)明為生命科學(xué)帶來一場革命，同時也積極推動了細(xì)菌視紫紅質(zhì)研究的發(fā)展。研究人員將細(xì)菌視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光照可引起氫離子外流，從而證明其為一種光控的氫離子通道。1977年，研究人員在細(xì)菌中又發(fā)現(xiàn)另一種視紫紅質(zhì)ü 鹵視紫紅質(zhì)(halorhodopsin)，后續(xù)證明其介導(dǎo)氯離子細(xì)胞內(nèi)流[8]。

圖3 細(xì)菌視紫紅質(zhì)

一系列的研究表明，即使簡單如細(xì)菌這樣的單細(xì)胞生物也存在 視覺系統(tǒng) ，標(biāo)志著一個新領(lǐng)域ü 低等生物視紫紅質(zhì)的誕生，從而促使科學(xué)家去尋找其他視紫紅質(zhì)。

4 藻類趨光

班貝格(Ernst Bamberg)是一位德國生物物理學(xué)家，從20世紀(jì)70年代開始研究細(xì)菌視紫紅質(zhì)的生物學(xué)功能，并利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BR是一種光激活氫離子通道。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和完善，生命科學(xué)的研究模式發(fā)生根本性改變，膜蛋白研究不再需要繁瑣困難的提取過程，只需將外源基因在特定宿主細(xì)胞表達(dá)即可。90年代，已加入德國法蘭克福馬普研究所的班貝格與從美國回來不久的德國電生理學(xué)家納格爾(Georg Nagel)決定合作，共同研究細(xì)菌視紫紅質(zhì)在完整細(xì)胞中的生物功能。1995年，他們合作將細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因成功轉(zhuǎn)入非洲爪蟾卵母細(xì)胞，進(jìn)一步精確證實(shí)光激活質(zhì)子泵的電壓依賴性[9]。2001年，他們進(jìn)一步在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中證實(shí)鹵視紫紅質(zhì)是一種氯離子通道(圖4)。班貝格與納格爾的合作一方面建立了視紫紅質(zhì)功能研究平臺，另一方面也初顯光遺傳學(xué)雛形，即將外源視紫紅質(zhì)在靶細(xì)胞表達(dá)。

圖4 藻類視紫紅質(zhì)

19世紀(jì)，綠藻(Chlamydomonas)等藻類就被發(fā)現(xiàn)具有向光性和受光調(diào)控的特性，但對這些現(xiàn)象背后的原因知之甚少。直到20世紀(jì)80年代，大量事實(shí)表明藻類也長 眼睛 ，即細(xì)胞膜存在感光物質(zhì)，稱為 光受體 。80年代初，德國生物物理學(xué)家赫格曼(Peter Hegemann)在博士就讀期間就決定研究光受體。赫格曼和學(xué)生以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為材料，借助電生理實(shí)驗(yàn)表明光的確可誘導(dǎo)藻類細(xì)胞產(chǎn)生電流[10]。赫格曼決定采用生物化學(xué)方法將光受體蛋白純化后研究其性質(zhì)。遺憾的是，十余年辛苦努力最終以失敗告終。根本原因在于光受體是一種膜蛋白，含量低、穩(wěn)定性差且異質(zhì)性高，這些都是蛋白質(zhì)純化的大忌。赫格曼不得不轉(zhuǎn)換研究思路來解決這個難題。

2001年，綠藻基因組測序的完成為問題的解決帶來轉(zhuǎn)機(jī)。赫格曼通過全面搜索和比對綠藻基因組數(shù)據(jù)庫，從中發(fā)現(xiàn)兩個候選基因與細(xì)菌視紫紅質(zhì)具有較高同源性。為加快研究進(jìn)程，赫格曼決定尋求合作。他在獲悉納格爾的研究工作后，積極溝通并與其達(dá)成合作協(xié)議。赫格曼小組負(fù)責(zé)克隆兩種綠藻視紫紅質(zhì)候選基因，并將其送給納格爾開展功能研究；納格爾則將基因轉(zhuǎn)入人腎胚細(xì)胞HEK293并實(shí)現(xiàn)正確表達(dá)。功能研究表明，它們的活性均受光調(diào)控，并且介導(dǎo)陽離子如鈉離子、鈣離子等的攝入(圖4)，因此將其分別命名為通道視紫紅質(zhì)(channelrhodpsin，ChR)1和2[11-12]。與ChR1相比，ChR2光激活時間更短，且離子通透性更強(qiáng)，因此更適合于研究。更為重要的是，赫格曼還推測這些通道視紫紅質(zhì)不僅可在普通細(xì)胞表達(dá)，而且也可在神經(jīng)元中表達(dá)并影響電生理活性。這一論斷直接催生了光遺傳學(xué)。

至此，研究人員已經(jīng)鑒定出三類光控視紫紅質(zhì)，分別是細(xì)菌視紫紅質(zhì)(介導(dǎo)氫離子輸出)、通道視紫紅質(zhì)(介導(dǎo)陽離子輸入)和鹵視紫紅質(zhì)(介導(dǎo)氯離子輸入)。它們在神經(jīng)功能研究方面具有何種應(yīng)用價(jià)值呢？這要從神經(jīng)興奮說起。

5 神經(jīng)興奮

大腦是神經(jīng)系統(tǒng)的中樞，是機(jī)體最復(fù)雜和最神秘的器官。知覺、運(yùn)動、興奮、情感、語言、學(xué)習(xí)和記憶等過程基本都在大腦特異區(qū)域完成。大腦由上百億神經(jīng)元(亦稱神經(jīng)細(xì)胞)構(gòu)成，這些神經(jīng)元之間通過特定方式實(shí)現(xiàn)彼此間交流，以達(dá)到協(xié)調(diào)控制機(jī)體各種行為的目的。

神經(jīng)元活性受電信號影響。正常情況下，神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)陰陽離子分布不均勻(這種現(xiàn)象稱為極性)：膜內(nèi)鉀離子濃度遠(yuǎn)高于膜外，膜外鈉離子濃度又遠(yuǎn)高于膜內(nèi)，最終形成一個外正內(nèi)負(fù)的狀態(tài)。未受刺激時(靜息狀態(tài))，規(guī)定膜外電位為0，則哺乳動物神經(jīng)元膜內(nèi)電位為負(fù)值，約-70 mV，稱為靜息電位；外界刺激可導(dǎo)致離子通道打開，由于離子移動而引起膜兩側(cè)離子濃度發(fā)生變化，電位差也隨之改變。如果-70 mV向0方向改變，則稱去極化(電位為0意味著內(nèi)外無離子濃度差距，極化消失)；相反，-70 mV向更大負(fù)值變化則稱超極化(意味著離子分布不均勻加劇)。一般而言，去極化伴隨神經(jīng)元激活，而超極化則意味著神經(jīng)元抑制，因此通過改變神經(jīng)元細(xì)胞膜內(nèi)外離子分布可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制神經(jīng)元活性的目的。

1979年，美國索爾克研究所著名科學(xué)家、DNA雙螺旋提出者之一克里克(Francis Crick，1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)在《科學(xué)美國人》發(fā)表一篇文章[13]，對腦科學(xué)未來的發(fā)展進(jìn)行展望。古典神經(jīng)生物學(xué)家通常采用電極刺激大腦特定區(qū)域神經(jīng)元的方式來影響行為，克里克認(rèn)為這種方法破壞性大且精確性不高，比如無法準(zhǔn)確區(qū)分不同的神經(jīng)元，這些因素導(dǎo)致所得結(jié)果準(zhǔn)確性差。為此，克里克提出應(yīng)開發(fā)一種精確控制神經(jīng)元活性的方法，允許研究根據(jù)需要只對特定神經(jīng)元打開或關(guān)閉，同時不影響非相關(guān)神經(jīng)元。具有分子生物學(xué)背景的克里克進(jìn)一步指出可以對神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，從而使它們可對外界信號(如光刺激)產(chǎn)生精準(zhǔn)性應(yīng)答。這一理念建立了光遺傳學(xué)的思想雛形。

盡管光控細(xì)胞行為的理念已經(jīng)提出，但真正實(shí)現(xiàn)則需要有可行的工具。2002年，這一想法終于首次變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

6 神經(jīng)光控

米森伯克(Gero Andreas Miesenb?ck)是一位奧地利神經(jīng)科學(xué)家，跟隨魯斯曼(James Edward Rothman，2013年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)開展博士后研究。他主要借助熒光系統(tǒng)來檢測神經(jīng)元內(nèi)囊泡運(yùn)輸，因而對光產(chǎn)生濃厚興趣。1999年，米森伯克建立自己的實(shí)驗(yàn)室，開始獨(dú)立的科研生涯，目光鎖定神經(jīng)生物學(xué)。米森伯克對整個神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域一知半解，可以說有點(diǎn) 門外漢 的味道，但是恰恰這個因素反而使他在光遺傳學(xué)方面首先完成突破，因?yàn)樗粫苤髁饔^點(diǎn)所羈絆。生命科學(xué)研究的基本策略在于首先控制某種因素(干預(yù))，然后依據(jù)結(jié)果確定因果關(guān)系，如敲除特定基因后動物出現(xiàn)某種表型異常(如個子變矮)，據(jù)此可認(rèn)為該基因參與了某個過程(如肢體發(fā)育)。然而，由于神經(jīng)系統(tǒng)自身的復(fù)雜性，長期以來神經(jīng)生物學(xué)家主要依賴形態(tài)觀察，而缺乏更多有效的干預(yù)手段。米森伯克想改變這一現(xiàn)狀，他完全從一個生物學(xué)家的視點(diǎn)來看待這個問題，因此想為神經(jīng)元安裝一套感光系統(tǒng)(遺傳學(xué)操作)，然后借助光照(光學(xué))來達(dá)到控制神經(jīng)元的目的[14]。為盡快實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，米森伯克邀請魯斯曼的另一位學(xué)生、自己的師弟澤梅爾曼(Boris Valery Zemelman)加入團(tuán)隊(duì)，啟動光控神經(jīng)元活性的研究計(jì)劃(圖5)。

圖5 米森伯克(左)和澤梅爾曼(右)

當(dāng)時可用的感光系統(tǒng)主要是動物視紫紅質(zhì)，而哺乳動物過于復(fù)雜的光轉(zhuǎn)導(dǎo)過程自然使米森伯克望而卻步，不得不尋找其他替代品。幸運(yùn)的是，他們在果蠅中找到一個簡單系統(tǒng)，該系統(tǒng)只需三種蛋白參與，分別為視紫紅質(zhì)抑制蛋白-2(arrestin-2)、視紫紅質(zhì)(rhodopsin)和G蛋白α亞基(G protein alpha subunit)。他們?yōu)樵撓到y(tǒng)杜撰一個名稱 chARGe ，之所以這樣命名，原因在于 charge 還有另一層含義 電荷 ，說明該系統(tǒng)目的在于通過影響離子(帶電荷的原子或原子團(tuán))運(yùn)動而改變動作電位。

整個實(shí)驗(yàn)主要有兩個關(guān)鍵步驟：首先將三種基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)皿中生長的海馬神經(jīng)元；其次測試光照轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元后動作電位的變化情況。2002年初，米森伯克小組首次在體外證明光照可控神經(jīng)元的活性[15]，從而開啟神經(jīng)生物學(xué)研究的新篇章。

然而，果蠅chARGe系統(tǒng)在應(yīng)用中存在諸多缺陷。首先需要三種蛋白，因此無論從轉(zhuǎn)基因效率還是三者協(xié)調(diào)能力都將大打折扣；其次盡管可產(chǎn)生動作電位，但時間長、幅度小，不易觀察和操作；最后，實(shí)驗(yàn)體系不穩(wěn)定，產(chǎn)生的動作電位無規(guī)律，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，從而也就意味著難以真正實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控。

為解決這些不足，米森伯克小組對其進(jìn)行改進(jìn)。他們選擇哺乳動物離子通道如P2X2和TRPV1等替代chARGe系統(tǒng)，這些通道蛋白都是單組分，因此大大降低實(shí)驗(yàn)難度，增加精準(zhǔn)度。然而，這些通道蛋白活性本身并不受光調(diào)控，而是與配體如ATP和capsaicin等結(jié)合相關(guān)。米森伯克借鑒博士后工作期間的靈感，成功設(shè)計(jì)出光照影響二者結(jié)合的實(shí)驗(yàn)體系，從而達(dá)到光控神經(jīng)元活性的目的[16]。但是，該系統(tǒng)也存在一些缺陷，如穩(wěn)定性差(間接作用引起)等，還有一大不足在于這些離子通道都是哺乳動物蛋白，因此外源基因和自身基因之間存在互相干擾，這種現(xiàn)象稱為系統(tǒng)不正交，從而為精準(zhǔn)調(diào)控帶來巨大難題。

2004年，美國加州大學(xué)伯克利分?？死?Richard Kramer)小組進(jìn)一步對鉀離子通道實(shí)現(xiàn)改造，最終也達(dá)到光控哺乳動物神經(jīng)元活性的目的[16]。然而，這些改進(jìn)整體而言效果有限，因此迫切需要成分少、速度快、強(qiáng)度高、正交好的光控系統(tǒng)。藻類通道視紫紅質(zhì)恰好滿足所有這些要求，因此，2002和2003年先后發(fā)表的藻類ChR文章立刻吸引了眾多科學(xué)家的目光，激發(fā)他們快速加入該領(lǐng)域。

7 光遺傳學(xué)

迪塞羅斯(Karl Alexander Deisseroth)是一位美國精神病學(xué)家和神經(jīng)科學(xué)家，1998年獲得斯坦福大學(xué)神經(jīng)科學(xué)博士學(xué)位，主要研究神經(jīng)元突觸活動影響細(xì)胞基因表達(dá)的機(jī)制，而該研究對理解大腦的記憶功能具有十分重要的意義。博士畢業(yè)后，迪塞羅斯最初想成為一名神經(jīng)外科醫(yī)生，因此在斯坦福醫(yī)學(xué)院完成實(shí)習(xí)和精神科住院醫(yī)師培訓(xùn)。然而，當(dāng)他在精神分裂癥患者治療過程中體會到明顯的無力感后，毅然決然改變選擇，轉(zhuǎn)向探索大腦的工作機(jī)制，以洞悉嚴(yán)重抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥等的發(fā)病過程，以期找到治療良策。隨后，迪塞羅斯進(jìn)入著名神經(jīng)生物學(xué)家錢永佑(Richard Tsien)實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)博士后工作，并在這里結(jié)識了畢業(yè)于麻省理工學(xué)院擁有物理和電氣工程背景的博伊登(Edward S. Boyden)。由于志趣相投，他們很快就成為科研摯友，并決定聯(lián)合開發(fā)一種精準(zhǔn)控制神經(jīng)元行為的工具(圖6)。他們最初設(shè)想采用磁控策略，未獲成功。稍后博伊登將目光轉(zhuǎn)向光控，對視紫紅質(zhì)產(chǎn)生濃厚興趣，并獲得細(xì)菌鹵視紫紅質(zhì)質(zhì)粒。遺憾的是，因其他事宜這一計(jì)劃未能實(shí)施。后來博伊登被米森伯克2002年發(fā)表的文章所深深觸動，決定重拾光控神經(jīng)元的研究計(jì)劃。不久他又讀到赫格曼發(fā)表的ChR2文章，很快就構(gòu)思出一個完美的研究計(jì)劃。

圖6 迪塞羅斯(左)和博伊登(右)

2004年2月，博伊登建議迪塞羅斯從納格爾那里借ChR2質(zhì)粒。3月，迪塞羅斯與納格爾達(dá)成合作協(xié)議，獲得ChR2質(zhì)粒使用權(quán)。質(zhì)粒到達(dá)后，兩人立即著手實(shí)驗(yàn)，但對實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒θ匀粵]有把握。首先，ChR2在神經(jīng)元能否高表達(dá)？其次，神經(jīng)元是否也不需要視黃醛輔助？需要的話將無形增加系統(tǒng)復(fù)雜性。第三，外源ChR2能否產(chǎn)生足夠電流而引發(fā)動作電位？最后，即使一切都順利，會不會被其他實(shí)驗(yàn)室搶先發(fā)表？因?yàn)樵S多研究人員已經(jīng)意識到光控的可行性。盡管有這些考量，但當(dāng)務(wù)之急則是加快研究進(jìn)程。迪塞羅斯通過優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染程序而使ChR2在海馬神經(jīng)元完美表達(dá)且正確定位于細(xì)胞膜，從而解除第一個擔(dān)心；博伊登檢測到表達(dá)外源ChR2的神經(jīng)元電在不添加視黃醛的前提下，藍(lán)光照射可在50 ms內(nèi)引起足夠陽離子流入，產(chǎn)生明顯去極化效應(yīng)。2015年1月，斯坦福大學(xué)本科生張峰(Feng Zhang)加入迪塞羅斯實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)一步構(gòu)建出包含ChR2的病毒載體，大大增加了轉(zhuǎn)染效率，電生理實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步證實(shí)其高效的光控活性[17]。

為取得發(fā)現(xiàn)優(yōu)先權(quán)，他們于2005年4月19日迅速將論文提交到美國《科學(xué)》雜志，卻被以沒有在神經(jīng)元中取得關(guān)于ChR2功能新發(fā)現(xiàn)的理由拒稿。5月5日，他們將文章轉(zhuǎn)投英國《自然》雜志，也同樣被拒稿。但幸運(yùn)的是，稿件隨后被轉(zhuǎn)到《自然-神經(jīng)科學(xué)》雜志，并最終被接收，于2005年8月在線發(fā)表[18]。這篇文章也被看作光遺傳學(xué)領(lǐng)域真正意義上的開山之作。隨后幾個月，多家實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)表文章證實(shí)光控神經(jīng)元活性的可行性。由于天然ChR2在實(shí)際應(yīng)用中仍存在諸多不足，研究人員在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行改造。他們通過采取點(diǎn)突變的策略制備得到一系列新型ChR2變體，極大地豐富了光遺傳學(xué)工具箱。2006年初，迪塞羅斯首次提出光遺傳學(xué)一詞[19]，用以描述聯(lián)合光學(xué)和遺傳學(xué)操作實(shí)現(xiàn)對特定神經(jīng)元活性(或動物行為)精準(zhǔn)控制的技術(shù)。

8 行為光控

體外光控神經(jīng)元活性僅影響動作電位，而更大的挑戰(zhàn)在于能否通過影響體內(nèi)神經(jīng)元動作電位進(jìn)而控制生物行為。該領(lǐng)域的首個突破來自米森伯克實(shí)驗(yàn)室。已知果蠅存在逃跑反應(yīng)，當(dāng)它們感知周圍存在威脅時會觸發(fā)大腦特定神經(jīng)元動作電位變化，進(jìn)一步影響其他神經(jīng)元活性并實(shí)施逃跑行為ü 飛走。米森伯克的學(xué)生利馬(Susana Lima)將光控蛋白基因轉(zhuǎn)入特定神經(jīng)元，隨后的光照就會造成果蠅逃跑反應(yīng)啟動。然而，該實(shí)驗(yàn)體系存在一個明顯的漏洞ü 果蠅本身對光線也非常敏感，單純光照也可引起正常果蠅逃離。為區(qū)分果蠅的逃跑行為源于直接光控還是視覺感知引起的間接效應(yīng)，米森伯克小組進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因果蠅頭部去除以消除它們的視覺系統(tǒng)(果蠅仍可存活一定時間)。這些無頭果蠅胸部仍保留神經(jīng)元，光照后它們?nèi)匀怀尸F(xiàn)逃跑反應(yīng)[20]，因而證實(shí)光確實(shí)直接控制神經(jīng)元活性。

相對于低等動物果蠅，小鼠的精準(zhǔn)行為光控就困難重重。首先，他們需要保證視蛋白只在特定神經(jīng)元如參與睡眠、記憶或焦慮等表達(dá)。為此，他們分離得到神經(jīng)元特異性啟動子序列，將其連接到ChR2基因上游，從而保證ChR2只在這類神經(jīng)元表達(dá)。其次，需要解決光照到達(dá)的問題。為此他們設(shè)計(jì)了一套設(shè)備，有效解決了這一難題。2005年，迪塞羅斯小組開始嘗試光控動物行為實(shí)驗(yàn)。他們首先成功制備下丘腦睡眠相關(guān)神經(jīng)元特異啟動子的ChR2轉(zhuǎn)基因小鼠，然后將該小鼠放置于黑暗房間并處于睡眠狀態(tài)，進(jìn)一步藍(lán)光刺激可喚醒小鼠，而正常小鼠則沒有這種應(yīng)答[21]。隨后，多個研究小組證實(shí)在動物水平上可實(shí)現(xiàn)光照控制行為的目的(圖7)。

圖7 光遺傳學(xué)動物

9 重大應(yīng)用

光遺傳學(xué)通過融合光學(xué)和遺傳學(xué)的操作技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對大腦特定神經(jīng)元的精準(zhǔn)時空控制。時間方面，控制精度可達(dá)毫秒量級；而空間方面，則可針對單一類型細(xì)胞。這一優(yōu)勢使光遺傳學(xué)在探索大腦行為機(jī)制和部分疾病治療方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。今天，全世界有上千家實(shí)驗(yàn)室在使用光遺傳學(xué)技術(shù)研究大腦行為及其他科學(xué)問題。

在基礎(chǔ)研究方面，神經(jīng)生物學(xué)家借助光遺傳學(xué)對許多大腦功能，如學(xué)習(xí)、記憶、新陳代謝、饑餓、睡眠、獎勵、動機(jī)、恐懼、嗅覺和觸覺等過程有了更為清晰的理解和認(rèn)識[22]，并且揭示眾多新機(jī)制，如個體特定狀態(tài)下(如焦慮、風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避等)大腦回路復(fù)雜行為的產(chǎn)生過程。光遺傳學(xué)技術(shù)還揭示帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的新機(jī)制，從而為藥物研發(fā)提供重要靶點(diǎn)，同時也為新藥篩選和測試提供重要技術(shù)平臺[23]。臨床應(yīng)用方面，光遺傳學(xué)有望在失明等疾病治療方面發(fā)揮重要作用。

未來幾年，隨著光遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，其價(jià)值將得到進(jìn)一步體現(xiàn)，有望從根本上提升對神經(jīng)系統(tǒng)以及非神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)生理和病理過程的理解和認(rèn)識，為部分疾病的治療帶來新突破。最近，光遺傳學(xué)還在非人類靈長類動物中開展相關(guān)研究，從而給未來臨床應(yīng)用帶來更大期望。當(dāng)然，光遺傳學(xué)本身涉及轉(zhuǎn)基因過程，因此安全性和有效性問題尚待進(jìn)一步評估。

光遺傳學(xué)在幾年內(nèi)已經(jīng)發(fā)展成為一種最先進(jìn)的技術(shù)，并給神經(jīng)生物學(xué)帶來一場革命[24]。2010年，光遺傳學(xué)被《自然-方法學(xué)》評為 年度方法 ，還被《科學(xué)》雜志評為十年重大突破[25-26]。這項(xiàng)技術(shù)突破使我們能夠解決以前無法想象的生物學(xué)問題。光遺傳學(xué)被認(rèn)為是自20世紀(jì)50年代以來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域最重大的進(jìn)展之一，可與腦電極使用、功能性磁共振成像相媲美。光遺傳學(xué)還直接推動2013年美國啟動腦科學(xué)計(jì)劃，大約耗資3億美元，旨在開發(fā)治療阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥和創(chuàng)傷性腦損傷等神經(jīng)疾病的藥物或技術(shù)。

光遺傳學(xué)的成就已得到學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可。許多作出卓越貢獻(xiàn)的科學(xué)家，如厄斯特黑爾特、班貝格、納格爾、赫格曼、米森伯克、澤梅爾曼、迪塞羅斯和博伊登等都先后獲得多項(xiàng)科學(xué)大獎，包括歐洲腦科學(xué)獎(2013年)[24]、美國科學(xué)突破獎(2014年)和加拿大加德納獎(2018年)[27]等?？梢灶A(yù)見，部分科學(xué)家還有望分享諾貝爾獎。由于神經(jīng)生物學(xué)一直是諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎青睞的重點(diǎn)領(lǐng)域(10年內(nèi)平均1～2項(xiàng))，光遺傳學(xué)獲諾貝爾獎也僅僅是時間問題。

10 科學(xué)啟示

通過光遺傳學(xué)的發(fā)展歷程，我們還可以得到如下啟示：

第一，微生物王國蘊(yùn)藏著無盡寶藏。從限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用(1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎和1980年諾貝爾化學(xué)獎)，到耐高溫DNA聚合酶的使用(1993年諾貝爾化學(xué)獎)，到視蛋白在光遺傳學(xué)的價(jià)值，再到今天基因編輯技術(shù)ü CRISPR-Cas9系統(tǒng)，無一不是將微生物成分借助基因工程應(yīng)用到哺乳動物。毫不夸張地說，基因工程及相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物至少有一半以上的貢獻(xiàn)。

第二，基礎(chǔ)科學(xué)對技術(shù)革新意義重大。沒有上百年來對光受體孜孜不倦的研究，沒有20世紀(jì)70年代細(xì)菌視紫紅質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和功能研究，沒有藻類ChR的基因克隆，就不會有光遺傳學(xué)的誕生，因此，強(qiáng)化基礎(chǔ)研究對新技術(shù)的發(fā)明和完善具有十分重要的意義。

第三，技術(shù)進(jìn)步對科學(xué)發(fā)展的推動作用。在知識日新月異的今天，許多科學(xué)問題的解決一方面依賴思維拓展，另一方面需要技術(shù)推進(jìn)。盡管光遺傳學(xué)的臨床應(yīng)用尚需時日，但這種技術(shù)手段對腦功能研究發(fā)揮了無法替代的作用，成為推動神經(jīng)科學(xué)發(fā)展的重要工具。