生物轉(zhuǎn)化技術(shù)制備稀有人參皂苷的研究進(jìn)展

劉蓉，許盼盼，李仕琳，張偉,2※

（1.遼寧科技大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 鞍山 114051；2.遼寧省精細(xì)分離工程技術(shù)中心，遼寧 鞍山 114051）

人參皂苷是從五加科植物（西洋參、人參、高麗參等）中提取出的一種四環(huán)三萜類(lèi)皂苷[1]。20世紀(jì)60年代，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有抗癌活性，人參皂苷成為抗癌天然藥物研究的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域。后來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的次級(jí)代謝衍生物具有更強(qiáng)的生物活性[2]。這種次級(jí)代謝衍生物被命名為“稀有人參皂苷”，直接從五加科植物中提取出來(lái)的人參皂苷稱(chēng)為“原型人參皂苷”。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60多種稀有人參皂苷[3-4]，其中包括Rk2、Rg3、Rh2、Rg5、Rh1、Rh3、Rk1等多種具備不同抗癌活性的稀有人參皂苷。由于稀有人參皂苷為人參皂苷的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在人參提取物中含量非常低，只能通過(guò)諸如化學(xué)反應(yīng)、生物轉(zhuǎn)化等手段獲得這些皂苷。而化學(xué)法轉(zhuǎn)化稀有皂苷存在反應(yīng)條件難以控制、產(chǎn)物復(fù)雜、污染環(huán)境的弊端[5]。因此，生物轉(zhuǎn)化法制備稀有人參皂苷的工藝和方法備受研究者持續(xù)關(guān)注。筆者通過(guò)調(diào)研近年來(lái)有關(guān)生物轉(zhuǎn)化法制備稀有人參皂苷的相關(guān)研究，對(duì)生物轉(zhuǎn)化手段制備稀有人參皂苷的研究成果進(jìn)行總結(jié)，旨在為研究者進(jìn)行稀有人參皂苷的制備提供參考。

1 稀有人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化方法

藥理研究結(jié)果證實(shí)了稀有人參皂苷具有良好的藥理活性，尤其是在抗腫瘤活性方面。同時(shí)人參皂苷的次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)苷和苷元的藥理活性及生物利用度也較人參皂苷理想。目前通過(guò)生物轉(zhuǎn)化手段制備稀有人參皂苷和苷元已被證實(shí)是切實(shí)可行的。生物轉(zhuǎn)化法是利用細(xì)胞或細(xì)胞器以及生物酶等對(duì)人參皂苷結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行修飾和水解的一種反應(yīng)溫和、目標(biāo)明確的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程[6]。同時(shí)，生物轉(zhuǎn)化法還具有選擇性強(qiáng)、目標(biāo)產(chǎn)物豐富、對(duì)環(huán)境危害小的優(yōu)點(diǎn)[7]。有較多生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)人參皂苷的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而獲得不同結(jié)構(gòu)的稀有人參皂苷。

1.1 微生物轉(zhuǎn)化法

人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化主要是利用微生物或酶對(duì)人參二醇類(lèi)皂苷的C3和C20位、三醇類(lèi)皂苷的C6和C20位的葡萄糖基進(jìn)行水解，使其定向轉(zhuǎn)化。圖1為人參皂苷水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑[6]。微生物轉(zhuǎn)化手段操作簡(jiǎn)便，副產(chǎn)物少，實(shí)際應(yīng)用最為普遍。王毅等[7]系統(tǒng)討論了腸內(nèi)生物菌群與人參皂苷轉(zhuǎn)化的關(guān)系，確定了生物轉(zhuǎn)化人參皂苷為苷元的基本研究思路。Bae等[8]利用乳酸菌將人參皂苷水解成C-K，分別利用2種腸道菌將Rg3成功轉(zhuǎn)化為Rh2和PPD。在此基礎(chǔ)上，研究還發(fā)現(xiàn)，除腸道菌外，對(duì)人參皂苷水解起作用的還有曲霉屬、青霉屬以及毛霉屬等生物霉菌[9-10]。董阿玲等[11]報(bào)道的黑曲霉和梨頭霉能夠?qū)g1轉(zhuǎn)化為Rh1，且轉(zhuǎn)化率可達(dá)80.9%；包海鷹等[12]報(bào)道了一種能將Re轉(zhuǎn)化為Rg1、Rg5和Rk1且轉(zhuǎn)化率可達(dá)92.2%的黑根霉。之后，研究人員又轉(zhuǎn)向利用同根同源理論對(duì)人參種植土壤進(jìn)行研究。崔宇等[13]在人參土中分離了鐮刀霉菌，實(shí)現(xiàn)了人參果總皂苷生物轉(zhuǎn)化C-K；遲美麗等[14]則從人參土中分離出2種球菌和桿菌，實(shí)現(xiàn)了生物轉(zhuǎn)化Rb1為Rg3；戴均貴等[15]則利用尖孢鐮孢霉將Rg1轉(zhuǎn)化成，2種稀有皂苷。

圖1人參皂苷水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑Fig.1 Transformation pathway of ginsenosides hydrolysates.

目前，微生物轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷的微生物方法基本是利用腸道厭氧菌和土壤微生物發(fā)酵2種手段。而腸道厭氧菌菌種復(fù)雜，需進(jìn)行篩選；土壤微生物轉(zhuǎn)化能力較弱，需要優(yōu)化發(fā)酵條件或者進(jìn)行生物誘變來(lái)提高轉(zhuǎn)化能力。微生物轉(zhuǎn)化的基本方式為底物-菌體細(xì)胞-產(chǎn)物，因此，微生物轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷及其苷元的方法仍受以下因素影響[16-17]：菌種，不同菌種或不同菌株均對(duì)人參皂苷的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)起決定作用；底物，單體皂苷和混合皂苷在微生物轉(zhuǎn)化中的效果不同，需要對(duì)混合皂苷純化來(lái)提高生物利用率；溫度和pH，這主要取決于微生物發(fā)酵過(guò)程的生長(zhǎng)條件。

1.2 生物酶法

生物酶法轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷也是目前研究較為廣泛的另一種轉(zhuǎn)化方法。相對(duì)于微生物轉(zhuǎn)化法，生物酶法具有生產(chǎn)周期短、污染小、選擇性高、轉(zhuǎn)化過(guò)程可控、專(zhuān)屬性強(qiáng)等特點(diǎn)。Ko等[18]采用不同類(lèi)型的糖苷水解酶對(duì)三醇型皂苷的水解過(guò)程進(jìn)行研究，并分別制備了Rg2、Rh1和F1等稀有人參皂苷。之后，又分別研究了糖苷水解酶對(duì)二醇型皂苷的水解過(guò)程，制備了F2、C-K、Rd和Rg3等稀有皂苷。趙立亞等[19]、金東史等[20]開(kāi)展了人參皂苷分離和生物轉(zhuǎn)化研究，利用-葡萄糖苷酶制備了Rh2，利用產(chǎn)酶菌實(shí)現(xiàn)了Rh2的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，且轉(zhuǎn)化率達(dá)60%，Rh2純度達(dá)90%。Noh等[21]將 -糖苷酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并應(yīng)用于C-K的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。楊元超[22]、薛蛟等[23]表達(dá)了人參皂苷生物合成基因，深入研究了不同皂苷的生物合成過(guò)程以及參與這些過(guò)程的基因（圖2）。如果能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的控制，就可以實(shí)現(xiàn)最大化的選擇性合成具有較高藥用價(jià)值的人參皂苷，甚至可以實(shí)現(xiàn)組織培養(yǎng)生產(chǎn)稀有人參皂苷。

圖2人參皂苷的生物合成過(guò)程Fig.2 Biosynthetic process of ginsenoside

2 稀有人參皂苷的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展

2.1 國(guó)際上稀有皂苷的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展

Kim等[24]利用從多年生人參中篩選出的乳桿菌M1成功將生物轉(zhuǎn)化后的人參皂苷總量增加20.6mg。Cui等[25]利用內(nèi)生真菌將人參皂苷轉(zhuǎn)化成稀有皂苷F2、C-K和Rh1，且F2的產(chǎn)率可達(dá)94.5%，C-K的產(chǎn)率提高到66.3%。

2.2 我國(guó)稀有皂苷產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀

2000年，我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)人參皂苷Rg3為處方藥，2006年，我國(guó)研發(fā)的人參皂苷 Rh2藥品也已批準(zhǔn)上市。但在稀有人參皂苷的產(chǎn)業(yè)化方面仍處于起步階段，國(guó)內(nèi)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)高純度人參皂苷單體的企業(yè)嚴(yán)重不足，具備稀有皂苷產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)能力的企業(yè)更少。主要原因是稀有人參皂苷不僅含量非常少，而且制備困難，分離工藝復(fù)雜，收率低[26]。未來(lái)?yè)屜染邆洚a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)稀有皂苷能力的企業(yè)必然具有市場(chǎng)話語(yǔ)權(quán)。只有積極開(kāi)展稀有皂苷的生物轉(zhuǎn)化研究才能對(duì)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備稀有皂苷提供必要的技術(shù)支持。

3 結(jié)論及展望

人參及其衍生產(chǎn)品需求的日益增長(zhǎng)已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。不僅在人參的組織培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化方面取得了一些進(jìn)展，而且還利用基因組學(xué)實(shí)現(xiàn)了生物合成制備人參皂苷。但近年來(lái)國(guó)內(nèi)、外人參稀有皂苷生物轉(zhuǎn)化還存在選擇性控制難、產(chǎn)物成分復(fù)雜、后期單體制備困難、收率偏低等不足之處。因此，只有積極開(kāi)展稀有人參皂苷生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的持續(xù)研究，并結(jié)合基因組學(xué)技術(shù)，培養(yǎng)、馴化高轉(zhuǎn)化率、高選擇性的潛在菌種，對(duì)于規(guī)模化制備稀有人參皂苷具有重要意義。