嗜熱鏈球菌發(fā)酵特性比較與分析

陸嘉誠，關(guān)成冉，張臣臣，陳大衛(wèi)，李啟明，王震，顧瑞霞，遲濤

(1.揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127；2.新希望乳業(yè)股份有限公司，成都610023；3.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150030）

0 引 言

嗜熱鏈球菌作為生產(chǎn)發(fā)酵乳的重要菌種[1]，被歐洲食品安全局認(rèn)定具有安全資格[2-3]，其重要性僅次于第一位的乳酸乳球菌[2]?，F(xiàn)代乳制品產(chǎn)業(yè)多采用的固定菌株，酸奶發(fā)酵劑的單一化，導(dǎo)致產(chǎn)品種類不足。由于國內(nèi)乳制品企業(yè)使用的發(fā)酵劑菌株主要依賴于進口，相關(guān)的研究技術(shù)、知識產(chǎn)權(quán)等幾乎完全被國外的廠家壟斷。因此，篩選具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良菌種作為發(fā)酵劑成為亟待解決的問題[4]。

本研究以實驗室分離保藏的11株嗜熱鏈球菌為研究對象，考察其產(chǎn)酸能力以及發(fā)酵乳的活菌數(shù)、粘度、持水力、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味等指標(biāo)，并采用主成分分析法對菌株進行評分，以期選出一株具有良好發(fā)酵性能的嗜熱鏈球菌。

1 實 驗

1.1 材料與設(shè)備

脫脂乳粉，全脂乳粉。嗜熱鏈球菌菌株來源：揚州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室凍藏保存。

SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，GYB60-08高壓均質(zhì)機，Legend mach1.6R高速冷凍離心機，F(xiàn)E20型p H計，RVD-Ⅶ黏度測定儀。

1.2 方法

（1）乳酸菌活化。將乳酸菌接種于新配置滅菌后的12%脫脂乳培養(yǎng)基中，混勻后42℃培養(yǎng)至凝乳，活化三代。

（2）發(fā)酵乳制備。全脂牛乳（質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%）→加入蔗糖→均質(zhì)（20 M Pa，60℃）→90-95℃熱處理5 min→冷卻至42℃→接菌→42℃發(fā)酵→4℃冷藏。

（3）酸度測定。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%酚酞作為指示劑，用濃度為0.1 m ol/L的N aOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。樣品取3個平行，取其平均值。

（4）p H值測定。用p H計測定發(fā)酵乳的p H值。

（5）持水力測定。取發(fā)酵乳樣品10 g至離心管中，室溫下離心，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心15 min。傾去離心管中上清液，將離心管倒置10 min后立即稱重，并按以下公式計算：

（6）活菌數(shù)測定。吸取1 m L發(fā)酵液至9 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水中。振蕩混勻后采用10倍稀釋，吸取1 m L稀釋液進行平皿傾注，42℃恒溫培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)。

（7）黏度測定。將發(fā)酵乳用玻璃棒正反方向各攪拌5次調(diào)整溫度至4℃，采用RVD-Ⅶ黏度儀測定發(fā)酵乳樣品的黏度，每個樣品平行測定3次，取平均值。

（8）質(zhì)構(gòu)測定。利用TM S-PRO質(zhì)構(gòu)儀，具體參數(shù)：12.7 mm圓柱探頭，觸發(fā)力0.05 N，測試速度60 mm/min，形變量20%，利用軟件測定算得到樣品的硬度、內(nèi)聚性等指標(biāo)。每個樣品做3次平行實驗。

（9）乙醛和雙乙酰質(zhì)量濃度測定。樣品中雙乙酰質(zhì)量濃度測定參考文獻[5]中的研究方法。樣品中乙醛質(zhì)量濃度測定參考文獻[6]中的研究方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用O rigin Pro8.5和SPSS21.0軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸能力比較

將活化好的11株嗜熱鏈球菌按3%接入滅菌脫脂乳（質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%）中，42℃發(fā)酵，發(fā)酵6 h過程中pH值和酸度變化如圖1所示。發(fā)酵初期1.5 h內(nèi)，11株菌的p H值和酸度變化趨勢平緩，尤其是R 704-2和RM 34-2。1.5～3 h間樣品的p H值下降迅速，介于0.6～1.15之間，滴定酸度急劇增加，平均酸度增長量達(dá)到28.49°T。3～4.5 h期間，pH值下降幅度開始變小，介于0.26～0.66之間，平均酸度增長量達(dá)到18.32°T。由圖(1)b可以看出，393-2，937，grx02，394-1，克菲爾-8，XPL-1-4，RM 34-2這7株菌在6 h達(dá)到發(fā)酵終點，平均產(chǎn)酸速率都達(dá)到11°T/h，其余4株菌的平均產(chǎn)酸速率低于10°T/h，其中393-2的產(chǎn)酸速率最高，為12.83°T/h；grx90的產(chǎn)酸速率最低，為6.85°T/h。

2.2 不同嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳黏度比較

圖1 不同嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過程中的變化

黏度是反映發(fā)酵乳品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，有研究表明，發(fā)酵乳黏度主要是因為嗜熱鏈球菌在發(fā)酵過程產(chǎn)生胞外多糖，胞外多糖多聚物作為增稠劑、膠凝劑增加了發(fā)酵乳的黏度且有助于改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)[7]。對11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳黏度進行測定，由圖2可以看出，不同嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳的黏度差異較大。grx02，XPL-1-4，394-1，克菲爾-8和YF-miX發(fā)酵乳的黏度介于3 000～5 000 M Pa·s；RM 34-2，822-1和grx90發(fā)酵乳的黏度介于5000～10 000 M Pa·s；393-2和R 704-2發(fā)酵乳的黏度介于15 000～20 000 M Pa·s；937發(fā)酵乳的黏度最高為23 982 M Pa·s。

圖2 11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳黏度

圖2中，標(biāo)注不同字母表示數(shù)據(jù)存在差異（P＜0.05），下同。

2.3 不同嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳持水力比較

持水力也是發(fā)酵乳品質(zhì)的一個重要評價指標(biāo)，持水力是衡量發(fā)酵乳經(jīng)離心處理后所能保留的水分的能力，大部分是與凝膠分子結(jié)合較牢的水分，可以較大程度的影響發(fā)酵乳的風(fēng)味和組織形態(tài)。衛(wèi)曉英等[8]研究表明，持水力過低會導(dǎo)致乳清析出，從而直接影響發(fā)酵乳的組織狀態(tài)與口感。由圖3可以看出，grx90，394-1，grx02，393-2和YF-miX發(fā)酵乳的持水力低于60%，而其他6株菌發(fā)酵乳的持水力超過60%，其中R 704-2發(fā)酵乳的持水力最高，達(dá)到66.93%。除394-1發(fā)酵乳外，其余10個發(fā)酵乳樣品持水力均在50%以上，優(yōu)于高微娟[9]、張睿[10]的報道，說明持水力較好，可用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)。

圖3 11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳持水力

2.4 不同嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳活菌數(shù)比較

乳酸菌活菌數(shù)是評價發(fā)酵乳功效的主要指標(biāo)之一[11]，Kum ar和Shah等人[12-13]認(rèn)為酸奶中發(fā)酵劑的活菌數(shù)應(yīng)該達(dá)到1×109m L-1，國標(biāo)對發(fā)酵乳最低活菌數(shù)的規(guī)定是1×106m L-1。對11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳活菌數(shù)進行測定。由圖4可知，不同菌株發(fā)酵的樣品活菌數(shù)差異較大，grx90發(fā)酵乳中活菌數(shù)最低，為7.76×107m L-1；grx02、YF-miX達(dá)到1×108m L-1；其他8株菌活菌數(shù)均達(dá)到1×109m L-1，說明這8株菌具有良好的活力，可作為潛在的發(fā)酵劑菌株用于發(fā)酵乳的生產(chǎn)。

圖4 11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳活菌數(shù)

2.5 不同嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)比較

質(zhì)構(gòu)特性是發(fā)酵乳的一項重要品質(zhì)指標(biāo)，不僅可以表示產(chǎn)品的組織狀態(tài)、口感等，還能進一步反映產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性[14-15]，對11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)進行測定。由表1可知，11個發(fā)酵乳樣品的硬度差異顯著，硬度是衡量凝膠強度的主要參數(shù)，硬度越大表明凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，抗形變能力強，937，XPL-1-4，RM 34-2和克菲爾-8發(fā)酵乳的硬度都達(dá)到了0.2 N，說明發(fā)酵乳內(nèi)部結(jié)構(gòu)較其他樣品更緊密。比較樣品的內(nèi)聚性可以看出：11個樣品的內(nèi)聚性差異顯著，其中394-1和grx90發(fā)酵乳的內(nèi)聚性達(dá)到0.6R atio，說明發(fā)酵乳的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更好。

表1 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果

2.6 不同嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳乙醛、雙乙酰質(zhì)量濃度比較

酸奶中，乙醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定產(chǎn)品質(zhì)量的好壞，它能賦予酸奶良好的芳香味[5]，不同菌株產(chǎn)乙醛量不同，由圖5可以看出，有3個發(fā)酵乳樣品的乙醛質(zhì)量濃度達(dá)到20 m g/L，393-2產(chǎn)乙醛的能力最強，為26.99 m g/L。其余8個發(fā)酵乳乙醛質(zhì)量濃度介于13.79～19.51 m g/L，RM 34-2產(chǎn)乙醛能力最弱，為12.91 m g/L。Sandine[16]等研究發(fā)現(xiàn)只有發(fā)酵乳中乙醛濃度超過8 m g/L，才能賦予產(chǎn)品良好的風(fēng)味，而當(dāng)發(fā)酵乳中乙醛質(zhì)量濃度超過30 m g/L時會產(chǎn)生令人不愉快的氣味。由此可知這11株菌均可賦予發(fā)酵乳良好的風(fēng)味。雙乙酰也是發(fā)酵乳的主要風(fēng)味物質(zhì)，能夠賦予發(fā)酵乳奶油香味。由圖6可以看出，11個發(fā)酵乳雙乙酰的質(zhì)量濃度介于4.54～8.06 m g/L，grx90產(chǎn)生的雙乙酰濃度最低，XPL-1-4產(chǎn)生的雙乙酰質(zhì)量濃度最高。

圖5 11株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳乙醛、雙乙酰質(zhì)量濃度

3 結(jié)果與分析

嗜熱鏈球菌發(fā)酵特性評價指標(biāo)的單位不同，量程大小不一，對8個評價指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，可避免不同單位和量程不一的影響。表2為經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后的各項數(shù)據(jù)。

主成分分析用少量的因素來描述多種指標(biāo)素之間的關(guān)系[17-18]。本研究利用SPSS 21.0軟件進行主成分分析，對11株嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸速率以及發(fā)酵乳的硬度、內(nèi)聚性、黏度、活菌數(shù)、持水力、雙乙酰質(zhì)量濃度和乙醛質(zhì)量濃度等8個指標(biāo)進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維。由表3得出主成分及方差貢獻率，第1、2、3主成分累計貢獻率可以達(dá)到86%以上，說明用這3個主成分能較好

表2 8個評價指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)

表3 總方差解釋

地代替上述8項指標(biāo)來評價嗜熱鏈球菌。

得分系數(shù)表示各個指標(biāo)對主成分的影響程度，通過得分系數(shù)可以將各個變量進行線性組合，建立第1主成分（Y 1）、第2主成分（Y 2）、第3主成分（Y 3）與硬度（X 1）、內(nèi)聚性（X 2）、持水力（X 3）、黏度（X 4）、活菌數(shù)（X 5）、雙乙酰質(zhì)量濃度（X 6）、乙醛質(zhì)量濃度（X 7）和產(chǎn)酸速率（X 8）這8個變量的得分系數(shù)模型：

第1主成分可提取為Y 1=0.245X 1-0.318X 2+0.248X 3-0.163X 4+0.285X 5+0.026X 6-0.188X 7+0.069X 8；

第2主成分可提取為Y2=-0.015X 1+0.020X 2-0.271X 3-0.007X 4-0.046X 5+0.268X 6+0.565X 7+0.369X 8；

第3主成分可提取為Y 3=0.017X 1+0.220X 2+0.202X 3+0.823X 4-0.145X 5+0.252X 6+0.035X 7-0.167X 8。

為了對比菌株發(fā)酵性能之間的差異，對菌株進行綜合評價。由方差貢獻率和主成分函數(shù)表達(dá)式，可得綜合評價函數(shù)：Y=0.45Y 1+0.24Y 2+0.17Y 3。由表5可知，嗜熱鏈球菌937的各主成分得分Y 1和Y 2均比其他

表4 主成分提取結(jié)果及成分得分系數(shù)

表5 綜合因子得分

菌株的得分高，比較各菌株的綜合因子得分Y可知，嗜熱鏈球菌937的綜合得分Y明顯高于其他菌。

針對11株嗜熱鏈球菌進行了產(chǎn)酸速率以及發(fā)酵乳的黏度、持水力、活菌數(shù)、乙醛和雙乙酰濃度等指標(biāo)的測定。通過主成分分析，從11株菌中選出了一株具有產(chǎn)酸速率快，發(fā)酵性能良好的嗜熱鏈球菌XPL-1-4。從綜合得分來看XPL-1-4的得分高于其他菌株，實驗結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌XPL-1-4可以作為發(fā)酵乳開發(fā)的優(yōu)良菌種。