巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長動力學(xué)模型的研究

魏釗異，方婷，李長城，彭亞博，李曉婷，潘潔茹，葉海梅，林侃

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福州350001；2.福州市疾病控制預(yù)防中心，福州350004）

0 引 言

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria m onocytogenes，LM）是一種常見的能引起人畜共患病的革蘭氏陽性短桿菌，可使人患腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)早產(chǎn)等疾病，危害嚴(yán)重。與其他食源性致病菌相比，由LM引發(fā)的李斯特菌病爆發(fā)幾率相對較低，但其致死率卻高達(dá)20%～30%[1]。世界衛(wèi)生組織（W orld Health O rganization,W HO）指出，包括蔬菜、奶及奶制品、肉制品在內(nèi)的消費(fèi)性食品，都受到不同程度的污染[2]，特別是在乳制品中普遍存在[3]。

巴氏殺菌奶采用低溫殺菌技術(shù)，能最大限度保證牛奶的營養(yǎng)成分不致流失，所以越來越受到消費(fèi)者的喜好,占液態(tài)奶銷量的50%左右[4]。LM在低溫（0～4℃）下仍能生長，是一種典型的耐冷細(xì)菌。并已有報道顯示，LM能夠耐受巴氏消毒，對生鮮乳、巴氏殺菌乳等相關(guān)乳制品造成食用風(fēng)險[5]。2007年11月，美國馬薩諸塞洲發(fā)生了一起由當(dāng)?shù)嘏Ｄ虉錾a(chǎn)的巴氏消毒乳引起的單增感染的暴發(fā)，造成5人感染，3人死亡[6]。

預(yù)測微生物學(xué)是以計算機(jī)為基礎(chǔ)，描述特定環(huán)境下微生物的生長、存活和死亡的情況，建立數(shù)學(xué)模型，從而為風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)。國內(nèi)外已有較多關(guān)于食品中單增李斯特菌的預(yù)測模型的研究。Li[7]研究5～30℃鹽漬與未鹽漬的三文魚魚籽中單增李斯特菌的生長動力學(xué)，結(jié)果表明，利用Ratkowsky平方根模型擬合得到的三文魚魚籽樣品中單增李斯特菌理論上的最低生長溫度為-0.5℃，與FDA報道的水產(chǎn)品中單增李斯特菌最低生長溫度（-0.4℃）非常接近。Fang[8]等人研究鮮切哈密瓜中單核增生李斯特菌和背景微生物的生長動力學(xué)，得出Arrhenius-type模型提供更準(zhǔn)確的估計單增李斯特菌在溫度(＜4℃)條件下的生長速率。鄒宇[9]等研究5、12、25、35℃牛奶中單增李斯特菌的預(yù)測模型，確定Gompertz方程為其在牛奶中的最優(yōu)初級模型，并采用Belehradek方程描述溫度對其最大生長速率和延遲時間的影響。

目前，尚未見有關(guān)巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長及其預(yù)測微生物學(xué)方面的報道。因此，本文擬用巴氏殺菌奶為原料，主要目的是通過初級模型和二級模型來描述單增李斯特菌在4～43℃范圍內(nèi)（4、8、12、16、20、25、30、37、40℃和43℃）的生長，并建立描述其生長規(guī)律的數(shù)學(xué)模型，以期為相關(guān)食品監(jiān)管部門開展巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的風(fēng)險評估提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴氏殺菌奶：市售，袋裝，產(chǎn)品標(biāo)注的保質(zhì)期為0～4℃下5 d。

單增李斯特菌菌株（CICC21632、CICC21633、CICC21635、CICC21639）購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、PALCAM瓊脂、腦-心浸出液肉湯（BHI）、蛋白胨粉：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；利福平：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AIRTECH生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；H-1850R高速冷凍離機(jī)：湖南相儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；SHP-250細(xì)菌生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KB115低溫恒溫箱：德國BINDER公司；VORTEX-5漩渦混合器：上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司；DX-200高壓滅菌器：德國Systec公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及接種菌液的制備

參照Fang[8]的方法，活化、培養(yǎng)及制備單增李斯特菌混合接種母液，并通過梯度稀釋，使單增李斯特菌濃度達(dá)5.5 log CFU/mL，備用。

1.3.2 巴氏殺菌奶樣品的準(zhǔn)備與接種

以無菌操作，將巴氏殺菌奶分裝到無菌試管中，每管10 mL，備用。將100μL單增李斯特菌混合菌液接種到每個無菌試管中，并充分震蕩均勻放入一定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 生長試驗(yàn)與計數(shù)

將已接種的樣品分別放置于4，8，12，16，20，25，30、37、40和43℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照預(yù)設(shè)的時間間隔取樣，測定單增李斯特菌菌落數(shù)，其中每個溫度條件設(shè)置10～14個取樣點(diǎn)。用PW梯度稀釋每個樣品，參照Fang[8]的方法采樣計數(shù)。

1.3.4 初級模型

分別采用Baranyi模型[10]和Huang模型[11]擬合各個溫度對應(yīng)的單增李斯特菌生長數(shù)據(jù)，其中Baranyi模型的表達(dá)式如式（1）和（2）所示，Huang模型的表達(dá)式如式（3）和（4）所示。

Y0，Ymax為初始菌濃度和穩(wěn)定期菌濃度/(ln CFU/g)；

μmax為比生長速率/(h-1)；

t為時間/h；

λ為遲滯期；

h0為反應(yīng)細(xì)菌所處的生理狀態(tài)，且h0=λμ；

α為常數(shù)(=4)，定義細(xì)菌生長時由遲滯后期向?qū)?shù)期轉(zhuǎn)化。

1.3.5 二級模型

分別采用Ratkowsky平方根模型[12]、Huang平方根模型[13]和Cardinal模型[14]，評價溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響，3種二級模型的表達(dá)式分別為式（5）～（7）。

式中：T0為最低生長溫度/(℃);

T為細(xì)菌所處的環(huán)境溫度/(℃)；

μmax為比生長速率/(h-1)；

Topt為最適生長溫度/(℃)；

μopt為最適溫度下的最適生長速率/(h-1)；

a、b為常數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)擬合與分析

本研究采用預(yù)測微生物學(xué)專用軟件IPM P 2013[15]對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理。采用方差分析（ANOVA）分析比較各個模型參數(shù)之間的差異，由此選擇最優(yōu)模型。

1.3.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用預(yù)測微生物學(xué)專用軟件IPM P擬合得到各個模型的最低生長溫度，做恒溫驗(yàn)證試驗(yàn)。將巴氏殺菌奶中接種單增李斯特菌后，放置在得到的最低生長溫度恒溫培養(yǎng)4天后，取樣、計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長特點(diǎn)

在各恒定溫度生長試驗(yàn)中，單增李斯特菌的初始接種量為5.0-5.5 log CFU/g，單增李斯特菌的生長曲線均表現(xiàn)出遲滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期3個階段。在試驗(yàn)溫度（4～43℃）范圍內(nèi)，其生長速率呈現(xiàn)出先增大后降低的變化。在低溫（4～8℃），其生長速率較低；當(dāng)溫度達(dá)到37℃，其生長速率達(dá)到最大；當(dāng)溫度達(dá)到40℃后，其生長速率又開始降低。

圖1 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌（LM）在不同溫度下（4～43℃）的生長曲線

2.2 初級模型比較分析

將各恒定試驗(yàn)溫度下單增李斯特菌所獲得的生長數(shù)據(jù)都可以用Huang模型和Baranyi模型來擬合，所得到的擬合曲線如圖1所示。除了對遲滯期和對數(shù)期向穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)折點(diǎn)的描述有差異外，2種模型均能較好地擬合巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長情況。統(tǒng)計參數(shù)RM SE、RSE、AIC值是衡量模型擬合精確度的重要指標(biāo)，一般來說，其數(shù)值越小，模型擬合的精確度越高。表1列出了2種初級模型的RM SE、RSE、AIC值，兩種模型的RM SE、RSE、AIC值在同一統(tǒng)計量取值較為接近，無顯著差異，可以認(rèn)為2種模型對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長曲線均具有良好的擬合精度。

表1 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌2種初級模型相關(guān)參數(shù)

在4～43℃時，Huang模型中，單增李斯特菌的μmax隨著溫度的增加，由0.017增加到1.024達(dá)到最大，當(dāng)?shù)?0℃后開始降低為0.743，43℃為0.498。Baranyi模型中，單增李斯特菌的μmax隨著溫度的增加，由0.017增加到1.005達(dá)到最大，當(dāng)?shù)?0℃后開始降低為0.721，43℃為0.512。比較擬合得到的H uang模型和Baranyi模型估算得到的單增李斯特菌生長速率之間的關(guān)系，回歸直線的斜率為0.9994（如圖2所示），R2＞0.99，表明由這兩種模型估算出的單增李斯特菌生長速率無顯著差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了2種初級模型對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長具有同等擬合效果。

圖2 Huang模型和Baranyi模型比生長速率之間的比較

由單增李斯特菌的生長特性可以知道，其耐低溫，在4℃的環(huán)境下仍然可以生長。劉珊娜[16]等人研究冷藏牛奶中單增李斯特菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)即使是在冷藏條件下，單增李斯特菌達(dá)到穩(wěn)定期的菌數(shù)有2 lg CFU/m L的增長。分析其原因是牛奶不但營養(yǎng)豐富，水分含量高，且pH接近中性，從而有利于微生物的生長繁殖；鄒宇[9]等也研究了單核細(xì)胞增生李斯特菌在牛奶中的生長預(yù)測模型，結(jié)果也證實(shí)該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，且在5、15、25和35℃4種不同溫度下的最大比生長速率分別是0.050、0.170、0.350和0.600。綜上發(fā)現(xiàn)，冷藏食品LM污染的風(fēng)險很高，而牛奶也給其繁殖提供了有利條件。巴氏殺菌奶須低溫儲藏，在本試驗(yàn)中，將其放置4℃進(jìn)行恒溫實(shí)驗(yàn)，其生長速率為0.017，達(dá)到穩(wěn)定期后單增李斯特菌的菌數(shù)也有1 lg CFU/m L的增長。

2.3 二級模型比較分析

圖3 3種二級模型描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率影響的擬合曲線

通過初級模型（H uang模型和Baranyi模型）擬合得到巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長速率無顯著性差異，所以可以將兩組生長速率的數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，建立溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率影響的二級模型。圖3是表明3種二級模型（R atkow sky平方根模型、Huang平方根模型、Cardinal模型）均可以用于描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。表2列出了Ratkow sky平方根模型、H uang模型、Cardinal模型模擬單增李斯特菌在巴氏殺菌奶中二級生長模型的相關(guān)參數(shù)。

表2 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌2種二級模型相關(guān)參數(shù)

由表2可知，由R atkow sky平方根模型、Huang平方根模型和Cardinal模型擬合得到的巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的最低生長溫度和最高生長溫度分別為：0.218、2.733、2.99和46.389、45.755、44.692℃，3種預(yù)測模型擬合出來的最高生長溫度很接近。根據(jù)國際微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICSM F）的報道，單增李斯特菌的最低、最適、最高生長溫度分別為-0.4，37℃和45℃[17]。Ratkow sky平方根模型推導(dǎo)出的單增李斯特菌的理論最低生長溫度為0.218℃，與ICSM F的報道更為接近，但最高生長溫度比報道的要高；Huang平方根模型和Cardinal模型預(yù)測的最低生長溫度分別為2.733℃和2.99℃，都高于了ICSM F報道的最低生長溫度；Huang平方根模型最高生長溫度為45.755℃，略高于報道的溫度，而Cardinal模型的最高生長溫度為44.692，比報道的溫度要略低。由此結(jié)果開展了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將接種單增李斯特菌的巴氏殺菌奶放置0.2℃恒溫培養(yǎng)4天后取樣、計數(shù)，發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌奶中單增李斯特菌增長了約0.4 Log，由此可知，Ratkow sk平方根模型更適合描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。

3 結(jié) 論

本文研究在4～43℃恒定溫度條件下，巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長動力學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)接種的單增李斯特菌在巴氏殺菌奶，放在低溫（4℃）條件下仍能生長，并發(fā)展成為完整的生長曲線，所有的曲線都包含有滯后期，指數(shù)期和穩(wěn)定期。使用Huang模型和Baranyi模型作為初級模型，對各個恒定溫度得到的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，綜合分析比較RM SE、RSE、AIC值和生長速率，結(jié)果表明兩種初級模型無顯著差異，均適合用于描述巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長狀況。

使用R atkow sky平方根模型[12]、Huang平方根模型[13]和Cardinal模型[14]作為二級模型，分析溫度對于單增李斯特菌生長速率的影響。結(jié)果表明，三種模型都可以描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。R atkow sky平方根模型推導(dǎo)出的單增李斯特菌理論最低生長溫度為0.218℃，與食品中的最低生長溫度相符。因此，Ratkow sky平方根模型更適合描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。本文研究了溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長動力學(xué)的影響，并測算了數(shù)學(xué)模型在預(yù)測微生物生長速率方面的應(yīng)用。研究所建立的模型可為相關(guān)食品監(jiān)管部門開展巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的安全風(fēng)險評估提供科學(xué)基礎(chǔ)。