副干酪乳桿菌的分離鑒定及腸道耐受性研究

印伯星

（1.揚(yáng)州大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009，2.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225004，3.江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州225004）

0 引 言

乳酸菌作為一類能夠利用糖類生長(zhǎng)并產(chǎn)生乳酸的益生菌[1]，因其具有保護(hù)人體腸道健康等益生作用引起了人們的高度關(guān)注。乳酸菌包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸菌和酵母菌屬等，其中乳桿菌數(shù)和雙歧桿菌屬被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)中[2]。副干酪乳桿菌廣泛存在于奶酪、泡菜等發(fā)酵食品中，其益生作用經(jīng)過(guò)了多年的實(shí)踐檢驗(yàn)[3]。Chen[4]等人利用副干酪乳桿菌發(fā)酵乳飲料，發(fā)現(xiàn)其在發(fā)酵后能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且降低腫瘤壞死因子-α（TN F-α）的產(chǎn)生。曹永強(qiáng)[5]等人利用副干酪乳桿菌N 1115發(fā)酵乳進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明攝入副干酪乳桿菌N 1115發(fā)酵乳后小鼠腸道內(nèi)短鏈脂肪酸含量顯著增多，有效改善了小鼠的便秘情況。但是由于副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌的親緣關(guān)系非常近，傳統(tǒng)的生理生化特性以及16S rDNA序列很難將其進(jìn)行區(qū)分[6]。因此，需要針對(duì)副干酪乳桿菌的特異性基因進(jìn)行鑒定，才能將其與干酪乳桿菌進(jìn)行有效區(qū)分。

本研究從西藏傳統(tǒng)乳制品中分離出35株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA序列測(cè)序比對(duì)后，初步將其中15株乳酸菌鑒定為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌群。再利用特異性基因recA[7]序列進(jìn)行鑒定分析后，將其中5株確定為副干酪乳桿菌，隨后對(duì)菌株環(huán)境耐受性進(jìn)行研究，為開發(fā)商業(yè)發(fā)酵劑和副干酪乳桿菌的鑒定提供了參考。

1 試 驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株與試劑

15株分離自西藏傳統(tǒng)乳制品中的干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌群，M RS培養(yǎng)基，溶菌酶，2×Taq PCR M aster mix，DL 2000 DNA m arker，牛黃膽酸鈉，鹽酸，胃蛋白酶，胰蛋白酶，碳酸氫鈉等，化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BCN 1360型生物潔凈工作臺(tái)，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，7000 PCR擴(kuò)增儀，DYY-10C型電泳儀，TGC-16G型離心機(jī)，Delta320 pH計(jì)等。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離及保藏

在無(wú)菌條件下，取傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品樣品100μL或0.1 g于900μL無(wú)菌生理鹽水（0.85%，w/v）中，振蕩混勻，得到10-1cfu/m L的菌懸液。然后對(duì)菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，將稀釋好的樣品分別接種于滅菌M RS固體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48～72 h，菌落形成后觀察并記錄菌落形態(tài)。隨后選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、菌落形態(tài)不同的單一典型菌落接種于液體M RS培養(yǎng)基中，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)18～24 h，對(duì)菌株進(jìn)行多次劃線純化。然后挑取單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，將確定為革蘭氏陽(yáng)性的菌株繼續(xù)活化，并對(duì)其進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。若菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，過(guò)氧化氫酶陰性，則將其暫定為乳酸菌，并進(jìn)行保種，以便進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 16S rDNA序列鑒定

首先采用改良的Chelex[8]方法對(duì)分離菌株DNA進(jìn)行提取，其方法如下：（1）取2 m L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液（菌液濃度為108cfu/m L），12 000 r/min，離心2 min，棄掉上清，收集菌體。（2）取1 m L生理鹽水反復(fù)洗滌菌體3次，12 000 r/min，離心2 min，棄掉上清。（3）菌泥中加入提取液（25%Chelex?100，0.5%NP40，1×TE緩沖液配制，pH=9.0），進(jìn)行56℃孵育30 min。（4）將上述混合液煮沸10 min，12 000 r/min，離心2 min，取上清液，即為DNA，保存于-20℃直至使用。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的菌株DNA進(jìn)行檢測(cè)。

隨后以菌株DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F和1492R，序列如下：27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'；1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，采用50μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，95℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR完成后進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 recA基因引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

本研究通過(guò)比較基因組學(xué)分析Lb.paracasei ATCC 334的全基因組序列，選取recA基因作為特異性靶基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，以區(qū)分干酪乳桿菌及副干酪乳桿菌[9]。recA基因引物設(shè)計(jì)結(jié)果如下：

表1 引物序列

PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 環(huán)境耐受性試驗(yàn)

1.2.4.1 耐酸性試驗(yàn)

2代活化的菌懸液于10 000 g，4℃離心5 min，然后用PBS清洗3次菌泥，按3%的接種量接種于HC l調(diào)整后p H值為3.0的液體M RS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，分別取0、1、2、3 h時(shí)的菌液稀釋涂布，以新鮮MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算存活率。

1.2.4.2 耐膽鹽試驗(yàn)

按3%的接種量將菌懸液接種于膽酸鹽濃度為0.3%的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)0、1、2、3和4 h時(shí)，分別取100μL樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取適當(dāng)梯度的稀釋液進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)，以新鮮MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算存活率。

1.2.4.3 人工胃腸液耐受性試驗(yàn)

活化2代的菌懸液離心后用PBS清洗3次，將菌泥重懸于經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌的人工胃液（0.35%胃蛋白酶、0.3%N aC l、調(diào)整至p H 3.0）中，37℃分別培養(yǎng)0、1、2、3 h時(shí)取100μL菌液稀釋涂布，用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，測(cè)定菌株在酸性胃液條件下的耐受性。當(dāng)菌體在人工胃液中處理3 h后，吸取1 m L含菌人工胃液，加入至9 m L經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌的人工腸液（1.1%碳酸氫鈉、0.3%N aC l、0.1%胰蛋白酶、0.6%膽鹽，調(diào)整至p H 8.0）中，于37℃培養(yǎng)，分別在0、3、5、7、8 h時(shí)吸取100μL菌液稀釋涂布，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)，測(cè)定菌株在腸中的耐受性。以新鮮M RS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算存活率。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3組平行，結(jié)果取平均值，利用M EGA軟件對(duì)分離菌株的16S rDNA序列和recA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用O rigin軟件作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離及16S rDNA測(cè)序

從傳統(tǒng)乳制品中分離出35株待定乳酸菌，進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示編號(hào)1到15的菌株全部為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌，運(yùn)用通用引物進(jìn)行PCR所獲得的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖1），發(fā)現(xiàn)無(wú)法區(qū)分菌株種屬。

2.2 recA引物擴(kuò)增結(jié)果

利用副干酪乳桿菌特異性基因recA設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)15株16S rDNA測(cè)序結(jié)果為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)存在清晰條帶。隨后針對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，確定其中5株為副干酪乳桿菌，分別編號(hào)為KY 1、KY 2、KY 3、KY 4和KY 5。利用M ega軟件將5株分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株(Lb.paracasei ATCC 334、Lb.paracasei ATCC 25302、Lb.paracasei JCM 8130、Lb.casei ATCC 393)的recA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，5株分離株與副干酪乳桿菌親緣關(guān)系更近，說(shuō)明recA基因可以較好的區(qū)分親緣關(guān)系較近的干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌。

圖2 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 耐酸性試驗(yàn)

人體中胃液的p H一般在2.5～3.5之間，食物在胃中的消化時(shí)間一般為1～3 h，因此選擇p H值3.0作為試驗(yàn)條件來(lái)評(píng)價(jià)菌株對(duì)酸的耐受性。針對(duì)5株篩選出的副干酪乳桿菌進(jìn)行耐酸性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如下圖3所示。由圖3可知，在pH值為3.0的MRS中生長(zhǎng)3 h后，副干酪乳桿菌KY 1、KY 2的存活率仍達(dá)到30%以上，說(shuō)明KY 1、KY 2對(duì)酸性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受性，因此選取副干酪乳桿菌KY 1和KY 2作為后續(xù)試驗(yàn)的試驗(yàn)菌株。SKask[10]等人研究了從奶酪中分離出的副干酪乳桿菌在內(nèi)的6株乳酸菌，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌在酸性條件下具有更高的生長(zhǎng)速率。

圖3 副干酪乳桿菌KY1-5對(duì)酸的耐受性（pH3.0）

2.4 耐膽鹽試驗(yàn)

本試驗(yàn)選取膽鹽濃度為0.3%的M RS，分別作用0、1、2、3、4 h后通過(guò)平板計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)菌株對(duì)膽鹽的耐受性。結(jié)果如圖4所示，可以看出副干酪乳桿菌KY 1和KY 2對(duì)膽鹽均具有很高的耐受性，在3 h時(shí)菌株存活率可達(dá)到69.1%和64.9%。膽鹽濃度的選擇是由于正常人體腸道內(nèi)膽鹽濃度最接近于0.3%[11]，因此本研究的耐受性試驗(yàn)具有較高的實(shí)際意義。

圖4 副干酪乳桿菌KY1、KY2對(duì)膽鹽的耐受性（0.3%）

2.5 耐人工胃液試驗(yàn)

人體胃液呈酸性，其中還含有一些酶類物質(zhì)，其酸性環(huán)境和酶類物質(zhì)對(duì)于乳酸菌發(fā)揮益生功能作用具有很強(qiáng)的抑制作用[12]，因此對(duì)胃腸液具有高耐受性的益生菌發(fā)酵劑具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本研究選取通常情況下胃中p H值為3.0的條件下，處理0、1、2、3 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，評(píng)估菌株對(duì)人工胃液的承受能力。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，模擬人工胃液處理3 h后，KY 1和KY 2的存活率分別為15.1%和13.2%。

圖5 副干酪乳桿菌KY1、KY2對(duì)人工胃液的耐受性

2.6 耐人工腸液試驗(yàn)

食物經(jīng)過(guò)胃部消化后進(jìn)入腸道，腸道中的菌群生長(zhǎng)會(huì)受到多種成分的影響，益生菌需要有能力耐受腸道內(nèi)的胰蛋白酶及堿性環(huán)境才能夠發(fā)揮其益生作用。小腸內(nèi)的pH一般在7.6左右，食物在小腸內(nèi)會(huì)停留3～8 h[13]。因此，本試驗(yàn)選取pH 8.0的人工腸液處理0、3、5、7、8 h后，通過(guò)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)副干酪乳桿菌KY 1和KY 2對(duì)人工腸液的耐受性。結(jié)果如圖6所示，兩株副干酪乳桿菌KY 1和KY 2在模擬人工腸液中處理8 h后存活率能夠分別維持到48.9%和48.3%，可見(jiàn)這兩株副干酪乳桿菌都具有很好的人工腸液耐受能力。

圖6 副干酪乳桿菌KY1、KY2對(duì)人工腸液的耐受性

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)西藏傳統(tǒng)乳制品中分離出的35株乳酸菌進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序和特異性recA基因擴(kuò)增，確定其中5株為副干酪乳桿菌，并發(fā)現(xiàn)recA序列可以較好的區(qū)分親緣關(guān)系較近的干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌。再針對(duì)這5株副干酪乳桿菌進(jìn)行耐受性評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果表明副干酪乳桿菌KY 1、KY 2具有較高的酸耐受性，膽鹽耐受性和人工胃腸液耐受性，意味著兩株副干酪乳桿菌KY 1、KY 2具有較高的潛力成為工業(yè)化發(fā)酵劑。