反義寡核苷酸下調(diào)miRNA-21表達對人結腸癌模型體內(nèi)生長的作用

劉士明，崔盼盼，丁濤，陳超，郭萌萌，徐林

0 引言

反義寡核苷酸技術（antisense oligonucleotides,ASOs）又稱反義技術，是指一種利用一段人工合成或表達的能與RNA或DNA互補結合的寡核苷酸鏈，抑制目的基因表達的技術[1-2]，也可用于干擾腫瘤細胞中特定基因的表達，從而探討腫瘤發(fā)生的機制和開發(fā)基因的治療策略。近來研究顯示，微小RNA-21（miR-21）與包括結直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生密切相關[3-8]，可能是腫瘤基因治療的潛在新靶標[9-10]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過ASOs可顯著下調(diào)人結腸癌SW620細胞中miR-21的表達，并抑制腫瘤的生長[11]。本研究中進一步利用人結腸癌HCT116細胞建立人結腸癌裸鼠實驗動物模型，觀察ASOs下調(diào)miR-21的效果及對人結腸癌細胞體內(nèi)生長的效應，為開發(fā)基于ASOs技術的人結腸癌基因治療策略提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞株和主要試劑

12只雌性BALB/c裸鼠，4～5周齡，體質量11～14 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物許可證編號：SCXK（京）2011-0011]，于遵義醫(yī)學院SPF級免疫學實驗室人工飼養(yǎng)。人結腸癌HCT116細胞株購自中國生命科學院，重組質粒p-miR-21-ASOs和對照質粒p-Cont均由本實驗室保存。McCoy's 5A培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自北京索萊寶科技有限公司，優(yōu)質胎牛血清購自美國Gibco公司，100×三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）購自上海第四制藥股份有限公司；SYBR Premix Ex Taq，Premix Ex Taq Version2.0以及RNAisoTMPlus均購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；miR-21探針試劑盒購自美國ABI公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成試劑盒購自美國Fermentas公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根科技有限公司，0.5%Triton-X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）購自北京索萊寶科技有限公司；APC標記的兔抗小鼠Ki-67單克隆抗體、DAPI染液均購自美國ThermoFisher公司；兔抗p-Akt、Akt一抗以及兔抗ERK1/2、p-ERK1/2一抗、HRP標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司；全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物公司；ECL顯色液、RIPA裂解液、PVDF膜購自中國聯(lián)科生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 按如下條件培養(yǎng)人結腸癌HCT116細胞株：人結腸癌HCT116細胞株在10%優(yōu)質胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、0.25 μg/ml兩性霉素B及11.9 g/L McCoy's 5A細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將人結腸癌HCT116細胞株置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待HCT116細胞處于對數(shù)生長期時，使用0.25%胰蛋白酶37℃消化2 min，離心收集細胞，使用PBS重復清洗3次，計算細胞總數(shù)，利用PBS調(diào)整HCT116細胞密度為4.5×107個/毫升備用。

1.2.2 建立人結腸癌裸鼠皮下移植瘤模型 4～5周齡裸鼠購回后先于本實驗室SPF級環(huán)境下觀察并飼養(yǎng)5～7 d。5～7 d天后小鼠飲食精神狀況良好，隨后接種100 μl密度為4.5×107個/毫升的人結腸癌HCT116細胞于裸鼠右側腋窩外側中部皮下，荷瘤后繼續(xù)飼養(yǎng)并隨時觀察注射部位有無紅腫潰爛、裸鼠的飲食、精神情況以及每只裸鼠荷瘤成功后的成瘤時間。接種后5～7 d出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤包塊時，即為荷瘤裸鼠模型構建成功。將實驗荷瘤小鼠隨機分為實驗組（p-miR-21-ASOs組）和對照組（p-Cont 組），每組6只，隨后每隔4 d分別向兩組荷瘤小鼠的腫瘤組織中注射100 μg p-Cont質粒和p-miR-21-ASOs質粒，共注射4次，并每隔3 d測量一次裸鼠皮下腫瘤體積。

1.2.3 觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長情況 觀察方法同前期工作[11]。

1.2.4 免疫組織熒光法檢測腫瘤組織中Ki-67蛋白的表達 從-80℃超低溫冰箱取出用75%冰乙醇固定好的冰凍組織切片，室溫（15℃～25℃）平衡10 min，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；山羊血清封閉液封閉1.5 h，PBS漂洗3次，每次10 min；加0.5%Triton-X-100，冰上破膜2 min，PBS漂洗3次，每次10 min；吸棄封閉液，滴加APC標記的兔抗小鼠單克隆Ki-67抗體后置于濕盒內(nèi)，4℃冰箱避光過夜孵育，次日，取出冰凍切片腫瘤組織用PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；滴加DAPI染液，染色3 min，PBS漂洗3次，每次10 min；滴加含有DAPI染液的封片劑，封片并固定24 h后觀察；激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況，拍片。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測腫瘤組織中miR-21和腫瘤生長相關因子的表達 腫瘤組織中miR-21、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin- dependent kinase, CDK）表達的檢測同前期工作[11]。

1.2.6 Western blot檢測Akt、ERK1/2、磷酸化Akt、磷酸化ERK1/2蛋白的表達 蛋白樣品的制備及BCA法定量蛋白的檢測同前期工作[11]。Western blot檢測相關信號通路的變化：（1）電泳：分離膠10%，積層膠5%，80 V跑積層膠，120 V跑分離膠；（2）上樣：第一泳道Marker，其余泳道加提取的總蛋白；（3）轉膜：PVD膜，36 V，180 min電轉；（4）洗膜：用TBS或者PBS洗膜；5 min一次；（5）封閉：用含5%脫脂奶粉的TBST或者PBST封閉1 h；（6）加一抗：加入相關目的蛋白的一抗（稀釋比例均為1:2 000），4℃過夜；（7）洗膜：次日用TBST或者PBST洗膜，10 min三次；（8）加二抗：加入HRP標記的相關目的蛋白的二抗（稀釋比例均為1:2 000），室溫孵育1 h；（9）用PBST洗膜，10 min×3次；（10）用發(fā)光試劑（ECl）對膜進行處理，于發(fā)光儀上進行蛋白曝光檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析。本研究中各實驗數(shù)據(jù)均獨立重復3次，結果以（x±s）表示。其中組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 p-miR-21-ASOs重組質粒注射后各組裸鼠荷瘤模型中腫瘤的生長變化

結果顯示，與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組皮下腫瘤生長顯著延緩，且腫瘤組織的體積、大小、重量都明顯減小，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。

2.2 腫瘤組織病理學改變

HE染色顯示：p-Cont組腫瘤細胞形態(tài)不一，細胞核深染且核呈多形性，核質比加大；而p-miR-21-ASOs組則可見腫瘤組織大面積壞死，見圖2。

圖2 重組質粒局部注射荷瘤裸鼠后腫瘤組織HE染色結果(×400)Figure2 HE staining results of tumor tissues after local injection of recombinant plasmid into xenograft tumor in nude mice (×400)

2.3 p-miR-21-ASOs重組質粒注射后腫瘤組織中miR-21成熟體的表達

結果顯示：與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組腫瘤組織中miR-21的表達水平顯著下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 Real-time PCR 探針法檢測腫瘤組織中miR-21的表達Figure3 Expression of miR-21 in tumor tissues detected by real-time PCR

2.4 免疫熒光技術檢測腫瘤組織中細胞的增殖

免疫熒光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)：相比于p-Cont組，p-miR-21-ASOs組腫瘤組織中Ki-67的表達水平明顯減少（P＜0.01），見圖4。

2.5 p-miR-21-ASOs重組質粒注射后周期蛋白依賴性激酶的表達

結果顯示：與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組腫瘤細胞生長周期相關的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4以及CDK6的表達水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05, P＜0.001），見圖5。

2.6 Western blot檢測腫瘤組織中相關信號通路的表達

結果顯示：與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組中p-ERK1/2，p-Akt的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05, P＜0.01），見圖6。

3 討論

近來的研究發(fā)現(xiàn)，ASOs技術可廣泛用于多種臨床疾病發(fā)生機制探討和治療策略開發(fā)[12-18]。對于腫瘤基因治療來說，利用ASOs技術干預特定基因表達來影響腫瘤生長方面的研究也取得了重要進展[19-20]。我們在新近工作中也發(fā)現(xiàn)利用真核載體過表達ASOs干預miR-21表達可顯著抑制人結腸癌SW620細胞的體內(nèi)生長[11]。本研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)，真核載體過表達ASOs也可有效抑制人結腸癌HCT116細胞中miR-21的表達，同時腫瘤細胞體內(nèi)生長受到抑制。范鈺等[21]用ASOs下調(diào)人喉癌Hep-2細胞中miR-21的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的生長、侵襲能力明顯減弱。吳子晏等[22]研究發(fā)現(xiàn)ASOs干預miR-21聯(lián)合順鉑在體內(nèi)、外能顯著抑制人骨肉瘤MG-63細胞生長，并促進細胞凋亡，顯示了一定的治療效應。這些研究結果提示，利用ASOs技術干預miR-21表達可能是一種能有效影響特定腫瘤生長的手段，為后續(xù)開發(fā)基于ASOs的人結腸癌基因治療策略提供了重要工作基礎。

圖1 重組質粒注射后裸鼠皮下種植瘤的腫瘤體積(A)、大小(B)和重量(C)變化Figure1 Tumor volume(A), size(B) and weight(C) in nude mice after subcutaneous injection of recombinant plasmid

圖4 p-miR-21-ASOs重組質粒注射荷瘤裸鼠后激光共聚焦檢測腫瘤組織中Ki-67的表達Figure4 Expression level of Ki-67 protein after injection of p-miR-21-ASOs recombinant plasmid into xenograft tumor in nude mice detected by immunof l uorescence technique

圖5 實時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織中CDKs的表達Figure5 Expression of CDKs in tumor tissues detected by real-time fl uorescent quantitative PCR

研究顯示，miR-21可通過對多種靶分子和信號途徑傳遞的調(diào)節(jié)來調(diào)控人結腸癌的生長[23-28]。在前期工作中，我們也發(fā)現(xiàn)ASOs下調(diào)miR-21表達后，腫瘤細胞生長相關信號途徑Akt和ERK1/2明顯改變，與其靶分子PTEN的表達變化有關[4,10]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)ASOs下調(diào)miR-21表達后，腫瘤組織存在壞死，腫瘤細胞的增殖能力明顯減弱，同時，腫瘤組織中p-Akt和p-ERK1/2等蛋白的表達水平均明顯下調(diào)，進一步提示了miR-21對Akt和ERK1/2等信號途徑的調(diào)控作用?，F(xiàn)已知，細胞內(nèi)CDKs家族分子的表達改變與腫瘤細胞生長相關。本研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞內(nèi)CDKs家族成員表達水平顯著減低。鑒于已有的研究表明，腫瘤細胞生長相關信號途徑Akt和ERK1/2與細胞內(nèi)CDKs家族成員表達間存在密切聯(lián)系[29-31]。因此，推測ASOs干預miR-21表達后對人結腸癌細胞體內(nèi)生長的抑制效應機制，包括腫瘤組織壞死的變化，與Akt和ERK1/2等信號途徑傳遞改變，進而影響CDKs家族分子的表達有關。然而，鑒于不同實驗條件的差異性，ASOs下調(diào)miR-21后抑制人結腸癌細胞體內(nèi)生長的確切分子機制仍有待后續(xù)研究闡明。

圖6 Western blot檢測腫瘤組織中總Akt、ERK1/2和Akt、ERK1/2磷酸化的水平Figure6 Expression levels of total Akt, ERK1/2, p-Akt and p-ERK1/2 in tumor tissues analyzed by Western blot

總之，本研究發(fā)現(xiàn)ASOs可顯著下調(diào)人結腸癌動物模型中腫瘤組織miR-21的表達，同時腫瘤體內(nèi)生長受到明顯抑制，該效應與Akt和ERK1/2等信號途徑傳遞變化有關，為后續(xù)深入探討miR-21調(diào)控腫瘤生長的分子機制，以及開發(fā)基于ASOs技術的人結腸癌基因治療策略提供前期實驗基礎。