腫瘤純度
——腫瘤研究中一個被忽視的潛在混雜因素

李嵐，許斌綜述，查莉審校

0 引言

免疫治療發(fā)展迅速，在多種腫瘤類型中都取得了重大突破，是一種前景廣闊的治療手段。但是，其在大多數(shù)實體瘤中有效率僅為20～30%[1]，而對于有效人群的篩選目前尚缺乏特異性手段。最常用的療效預測標志物有細胞程序性死亡配體-1（programmed cell death ligand-1, PD-L1）表達水平、腫瘤突變負荷（tumor mutational burden,TMB）、高度衛(wèi)星不穩(wěn)定性或錯配修復缺陷等[2-5]。腫瘤組織結構復雜，除了腫瘤細胞，也有基質細胞、炎性細胞、脈管系統(tǒng)和細胞外基質等，共同構成腫瘤微環(huán)境[6]。研究顯示PD-L1表達量與免疫檢查點抑制劑療效呈正相關，但未明確區(qū)分PD-L1表達的細胞來源，如腫瘤細胞還是免疫細胞或是腫瘤微環(huán)境中其他細胞[7]。

腫瘤純度是指腫瘤組織中腫瘤細胞所占的比例。研究顯示腫瘤純度與腫瘤患者的臨床特征、基因組表達和生物學特性均顯著相關，忽視腫瘤純度的影響可導致腫瘤基因分型、復發(fā)風險及療效預測等過程產生系統(tǒng)性偏倚[8]，準確評估腫瘤純度有助于客觀分析腫瘤樣本。然而，目前極少有腫瘤分型、臨床研究、標志物檢測等研究過程考慮了腫瘤純度的影響。非腫瘤細胞影響腫瘤純度，在腫瘤生物學中扮演重要的角色。本文主要從概念、計算方式及對基因組分析的影響三個方面介紹腫瘤純度。

1 腫瘤純度概念

臨床工作中獲得的腫瘤組織往往混合了非腫瘤細胞，其在腫瘤生長、進展或耐藥等過程中具有重要作用，如基質或間質細胞可促進腫瘤生長并影響腫瘤治療反應[9]，而免疫細胞如腫瘤浸潤性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）可能抑制腫瘤生長[10]。

腫瘤組織中腫瘤細胞所占的比例即為腫瘤純度。腫瘤純度很大程度上取決于腫瘤組織的獲取方式，標準的腫瘤手術標本取樣純度通常低于70%。雖然癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫認為60%的純度就足以區(qū)分腫瘤成分與非腫瘤成分，但是腫瘤純度會導致基于基因組分析的腫瘤研究結果產生系統(tǒng)性偏倚，對腫瘤純度進行評估可以減少分析偏倚[11]。

2 腫瘤純度的計算

細胞分選技術和單細胞測序可以用于確定腫瘤純度，但由于成本和技術的限制，不可能用于大規(guī)模研究。傳統(tǒng)的腫瘤純度計算方法是根據(jù)病理圖像分析來估計，往往受組織病理學、觀察者和試劑儀器精確度等各方面的影響。隨著基因組學、表觀遺傳組學、計算機及統(tǒng)計學等方面技術的發(fā)展進步，已經可以根據(jù)腫瘤樣本的基因表達、突變、拷貝數(shù)或甲基化數(shù)據(jù)分析計算腫瘤純度[12-14]。

2.1 經典計算方法

（1）HE染色。通過蘇木精和伊紅染色劑載玻片的圖像分析來估計腫瘤純度。（2）白細胞去甲基化純度（leukocytes unmethylation for purity,LUMP）。根據(jù)44個非甲基化免疫特異性CpG位點平均值計算白細胞非甲基化程度，進而估計腫瘤純度。（3）ABSOLUTE[13]。通過SNP array（基因芯片技術）測量體細胞拷貝變異數(shù)據(jù)，利用極大似然模型估計腫瘤純度，是一種直接測量樣本中的腫瘤細胞的計算方式。大多數(shù)TCGA樣本都采用ABSOLUTE方式計算腫瘤純度，被認為是純度估計的金標準。（4）ESTIMATE[15]。利用單個樣本的基因富集分析以及免疫細胞和基質細胞的基因表達譜，推斷腫瘤樣本中基質細胞和免疫細胞浸潤程度，根據(jù)經驗累計分布函數(shù)來估計腫瘤細胞純度。LUMP和ESTIMATE是通過測量樣本中免疫成分和基質成分間接評估腫瘤純度，這兩種方法無法測量樣本中非免疫和基質成分（如正常細胞）的存在，評估出的腫瘤純度較ABSOLUTE可能有差異。有研究者利用這四種方法計算出的腫瘤純度的中值作為腫瘤樣本純度。

2.2 新型計算方法

圖1 腫瘤樣本(A)及正?；瘶颖?B) 甲基化分布圖譜 [16]Figure1 Distribution of methylation level in tumor tissues(A) and normal control(B) [16]

（1）Zheng等[14]提出的統(tǒng)計算法MethylPurify是利用亞硫酸氫鹽來顯示差異甲基化區(qū)域，從而僅從單個腫瘤樣品推斷腫瘤純度，是第一種不需要正常細胞、腫瘤細胞或細胞學基因組變異信息或其他信息進行參照的方法，但是該方法需要足夠高的亞硫酸氫鹽的測序深度，價格昂貴，限制了其臨床應用。（2）系統(tǒng)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中32種腫瘤類型的450k甲基化芯片數(shù)據(jù)之后發(fā)現(xiàn)：與正常樣本相比，腫瘤樣本甲基化水平除了在0/1附近富集，在中間區(qū)域也出現(xiàn)了一個明顯的峰，腫瘤樣本在中間甲基化區(qū)域位點的比例更高，而這種現(xiàn)象正是由于腫瘤樣本“不純”導致，見圖1。InfiniumPurify則利用腫瘤樣本中與正常樣本甲基化差異顯著的位點，將其分為高甲基化組和低甲基化組，然后利用高斯核密度估計方法計算腫瘤樣本的純度。該方法估算出的腫瘤純度值與ESTIMATE、ABSOLUTE、LUMP、IHC等經典方法得到的結果有較高的一致性，進一步分析發(fā)現(xiàn)，當正常樣本個數(shù)大于或等于30時，腫瘤樣本純度估計與樣本的選擇無關[16-17]。在此基礎上進一步開發(fā)的UiInfiniumPurify則利用腫瘤樣本和正常樣本通用的CpG位點估計腫瘤純度，可運用于TCGA數(shù)據(jù)庫之外腫瘤樣本較少的腫瘤組織純度估計[18]。（3）AbsCN-seq是Bao等[19]開發(fā)的一種簡單穩(wěn)定的可根據(jù)全基因組測序數(shù)據(jù)中評估腫瘤純度的算法。在NCI60細胞系、dbGAP、TCGA等數(shù)據(jù)庫中驗證，與ABSOLUTE一致性良好，并且可與ABSOLUTE互補，用于對方不適用的情況。（4）PAMES（Purity Assessment from Clonal Methylation Sites）是Benelli等[20]開發(fā)的利用高度克隆的腫瘤類型特異性CpG位點的甲基化水平來估計腫瘤樣品純度的方法，不需要匹配正常對照，也不受腫瘤微環(huán)境的影響。在不同數(shù)據(jù)集的6 000多個樣本和腫瘤細胞系進行了驗證評估，與其他方式的計算結果高度一致。并且研究者將PAMES的計算能力擴展到利用CpG島進行分析，而不僅限于特異性的CpG位點。（5）Sequenza是Favero等[21]開發(fā)的利用配對的腫瘤DNA和正常細胞DNA外顯子測序數(shù)據(jù)估計腫瘤純度的軟件。利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的30個腫瘤樣本的外顯子數(shù)據(jù)進行驗證，Sequenza分析結果與等位基因特異性拷貝數(shù)函數(shù)分析SNP array的檢測結果高度一致，并且優(yōu)于AbsCN-seq、ABSOLUTE。此外，除了計算腫瘤純度，目前已構建多種校正腫瘤純度的基因組分析統(tǒng)計模型，如差異表達分析、表達數(shù)量性狀基因座識別、聚類分析等[22-24]。

3 腫瘤純度對基因組分析的影響

腫瘤純度是否代表生物學相關性和腫瘤內在特征，或是僅僅代表外在特征（如手術切除和組織準備）所決定的系統(tǒng)性偏倚仍存在爭議。（1）Aran等[8]評估了數(shù)百個臨床特征與腫瘤純度之間的相關性，但并未發(fā)現(xiàn)兩者之間有明確關聯(lián)，故認為腫瘤純度差異很大程度上取決于外在因素。（2）Zhang等[25]針對腦膠質瘤的分析表明純度較低的腫瘤惡性程度更高、預后更差，將腫瘤純度作為影響因子納入預測預后的列線圖中精確度顯著提高。不同純度的樣本基因組學特征也有所不同，低純度的膠質瘤多具有7號染色體擴增與10號染色體缺失（膠質母細胞瘤基因組標志），高純度的膠質瘤多具有染色體1p19q共缺失（少突神經膠質瘤的基因組標志）。此外，低純度膠質瘤免疫表型更強。（3）在結腸癌研究中也發(fā)現(xiàn)低腫瘤純度是預后差的獨立預測因素，純度低的腫瘤突變負荷更高，免疫表型更強[26]。

腫瘤純度具有重要的臨床、基因組和生物學意義，是癌癥基因組或轉錄組分析的重要混雜因素。

3.1 對腫瘤轉錄組分析的影響（以免疫相關基因為例）

腫瘤組織混合了腫瘤細胞和非腫瘤細胞的RNA轉錄物，其中非腫瘤細胞RNA轉錄物會影響腫瘤表達譜，使腫瘤轉錄組分析復雜化。Aran等[8]的研究表明腫瘤組織中正常細胞特別是免疫細胞的比例，可使遺傳分析或其他檢測的結果產生嚴重偏差。免疫細胞是非腫瘤細胞主要成分之一，腫瘤組織中免疫相關基因的表達可能與其有關，因此腫瘤轉錄組分析尤其是側重于免疫相關基因的分析必須考慮腫瘤純度的問題。腫瘤基因組的TMB和免疫治療相關靶基因的表達被認為是免疫檢查點抑制劑療效的可靠預測指標，但是只有當腫瘤組織中免疫細胞的浸潤程度明確量化時，這些指標用于預測檢查點抑制劑藥物有效性才是精確的。

Rhee等[11]從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得21種腫瘤類型共7794例腫瘤標本的RNA測序基因表達譜和腫瘤純度，計算個體基因表達和腫瘤純度的相關性，據(jù)此將基因分為與腫瘤純度正相關或負相關兩組，并進行基因富集分析以鑒定兩組基因的分子功能。結果顯示：與腫瘤純度負相關的基因中免疫相關基因持續(xù)富集，與腫瘤純度正相關的基因根據(jù)不同的分子功能富集。腫瘤純度較低的腫瘤樣本免疫細胞更多，突變負荷往往較高，因為免疫細胞引起的炎性反應可以增加腫瘤細胞的突變率，免疫治療效果可能更佳[8]。有研究表示免疫相關基因的表達與突變負荷之間具有一定的相關性。粒酶A、穿孔素-1可代表腫瘤浸潤性T淋巴細胞活性，計算兩者表達的幾何平均值作為細胞溶解活性（cytolytic activity, CYT），研究顯示CYT與突變負荷顯著相關，與患者總生存率一定程度上相關[27]。然而，Rhee等發(fā)現(xiàn)CYT和突變負荷均與腫瘤純度顯著負相關，控制腫瘤純度之后，免疫相關基因與突變負荷的相關性降低，可能與腫瘤純度有關。進一步研究在控制或不控制腫瘤純度時CYT和生存率之間的關系發(fā)現(xiàn)，未控制腫瘤純度時，乳腺浸潤癌、低級別膠質瘤、肝細胞癌和皮膚黑色素瘤等多種腫瘤中都觀察到顯著相關，但在控制腫瘤純度之后，僅膀胱尿路上皮癌顯示CYT基因表達與患者存活率之間有顯著關聯(lián)。即CYT基因表達與生存率的相關性也可能是由腫瘤純度引起的。不同腫瘤類型的CYT與生存關系的差異可能不能單純用腫瘤純度來解釋，但也應將腫瘤純度作為臨床病理特征相關性分析，如患者免疫基因的表達與存活率的相關性分析中潛在的混雜因素。

免疫相關基因在與腫瘤純度呈負相關的基因中占主要部分，且無論腫瘤純度如何，免疫相關基因始終與腫瘤純度負相關。從轉錄組數(shù)據(jù)中獲得免疫治療表達標志物時需要考慮腫瘤純度。

3.2 對基因聚類的影響

基因聚類分析是將基因分為數(shù)類，并使同一類的基因盡可能相似，而不同類的基因相似度很小。通過在分子標記的基礎上對腫瘤進行分組的基因聚類可對腫瘤進行亞型分析，實現(xiàn)精準治療。腫瘤純度在多種腫瘤類型中對基因共表達和基因聚類有重要影響，大量基因對在純度調整后失去了聚類成員一致性，并且在不同腫瘤類型中影響程度不盡相同[11]。

通過共表達基因對可以發(fā)現(xiàn)腫瘤相關驅動基因和與轉移相關的分子通路，而有研究發(fā)現(xiàn)共表達基因對的出現(xiàn)可能僅僅歸因于腫瘤純度。膀胱癌中JAK3和CSF1R為高水平共表達基因對，提示這兩個基因可能采取共同的機制促進腫瘤發(fā)展。但如果考慮腫瘤純度，兩者共表達差異很大，純度高的腫瘤中兩者表達的相關性不大，因此這兩個基因在膀胱癌驅動和轉移通路中是否具有聯(lián)合作用還有待確定，也突出了純度調整的必要性[8]。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在聚類分析時，具有相似純度的腫瘤樣本傾向于分為一類，如腫瘤純度較低的樣本，其甲基化譜與正常細胞甲基化譜更接近的傾向于分為一類。Rhee等[11]將基因通過聚類分析分配到六個基因簇中，基因對按照是否屬于同一簇分為聚類匹配對和聚類不匹配對，然后分別在控制或不控制腫瘤純度時檢查了基因對的聚類成員。結果顯示在部分腫瘤類型中，屬于同一簇的基因對在控制腫瘤純度后55%以上將被分配到不同的簇。為進一步驗證校正基因純度的必要性，分別測量控制腫瘤純度前后聚類匹配對和聚類不匹配對的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction, PPI）基因對的頻率。無論控制腫瘤純度與否，聚類匹配對PPI基因對頻率均高于聚類不匹配對，控制腫瘤純度前后聚類匹配結果一致的基因對中PPI基因對頻率比不一致基因對更高，純度調整可以增加基因聚類的功能一致性。

3.3 對分子分類的影響

利用特征基因作為基因分類的標志可對腫瘤進行分子分類，腫瘤純度可能影響該過程[28]。腫瘤純度在不同腫瘤亞型中有所不同，特征基因在不同腫瘤亞型和整體腫瘤中與腫瘤純度的相關性也不同。如840個特征基因將TCGA多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）分為四個亞型（前神經元型、神經元型、經典型和間質型），代表四個GBM亞型的特征基因與腫瘤純度顯著正相關（前神經元型和經典型）或負相關（神經元型和間充質型）[11]。而GBM特征基因對正相關或負相關的單一分布正好可以解釋Aran等[8]觀察到的整體GBM特征基因表達與腫瘤純度相關性的雙峰分布。進一步使用與腫瘤純度正相關或負相關的部分特征基因進行分層聚類，發(fā)現(xiàn)主要在神經元型和前神經元型分子分類中存在干擾。GBM的分子分類學以及特征基因的選擇可能因腫瘤純度而有偏差[11]。類似的其他研究也發(fā)現(xiàn)間質腫瘤亞型的代表性表達信號主要歸因于基質細胞，而不是腫瘤細胞[29-30]。

3.4 對差異分析的影響

基因突變導致基因表達模式發(fā)生異常，這些差異表達的基因可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。研究發(fā)現(xiàn)差異分析也受腫瘤純度的影響。在不考慮腫瘤純度的情況下，對腫瘤免疫治療重要靶點CTLA-4和CD86蛋白的相對表達進行差異分析的結果可能有偏倚[8]。此外，校正腫瘤純度的差異表達分析可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)差異表達分析不能檢測的免疫治療基因特征[8]。

4 展望

對腫瘤進行基因組分析有助于增進對腫瘤的理解，了解其發(fā)生發(fā)展的分子機制，幫助腫瘤的早期診斷和治療，更是腫瘤精準治療的基礎。然而，腫瘤是一種復雜的微環(huán)境，除了腫瘤細胞還有其他多種細胞類型，如正常細胞、免疫細胞、基質細胞、血管細胞等，腫瘤組織的不純會使遺傳分析及其他檢測結果產生嚴重偏差。腫瘤純度對基因組分析，包括基因轉錄組分析、基因聚類、分子分類和差異分析等各方面都有顯著影響，因此，對腫瘤組織進行分析時除了腫瘤細胞，也該關注非腫瘤細胞并建立合適的統(tǒng)計模型計算腫瘤純度，以校正腫瘤純度對基因組分析帶來的偏差。腫瘤純度的影響給腫瘤精準治療帶來更多的挑戰(zhàn)與困難，希望將來有更多針對腫瘤組織的研究將腫瘤純度精確測量納入分析，以校正腫瘤純度的影響，準確闡述腫瘤生物學的基本原理，為患者的精準化個性醫(yī)療開辟新的途徑。