凍融次數(shù)對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白功能和結(jié)構(gòu)特性變化的影響

鄧思楊，王 博，李海靜，鐘 強(qiáng)，董春暉，夏秀芳*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

鏡鯉魚(yú)又名三道鱗，是2010年由黑龍江水產(chǎn)研究所從西德引入的歐洲鯉魚(yú)的變種，其典型特點(diǎn)是鱗片少、肉質(zhì)嫩滑、生長(zhǎng)繁殖周期短、蛋白質(zhì)含量高（17.6%）、不飽和脂肪酸含量高。因此在運(yùn)輸、加工和貯藏期間極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。

冷凍是鏡鯉魚(yú)最常見(jiàn)的貯藏方式，能有效地保持魚(yú)肉新鮮度，但凍藏期間因冷鏈技術(shù)不健全，在運(yùn)輸、消費(fèi)過(guò)程中以及在餐館、家庭和零售環(huán)境中極易引起貯存期間溫度波動(dòng)和多次凍融循環(huán)的發(fā)生，引起魚(yú)肉品質(zhì)和物理化學(xué)特性變化[1]。在冷凍和凍藏過(guò)程中，魚(yú)肉內(nèi)冰晶的大小及所處位置可能破壞肌肉細(xì)胞，并導(dǎo)致線粒體和溶酶體釋放進(jìn)入肌漿，導(dǎo)致機(jī)械損傷和肌肉組織質(zhì)量的損失[2]。冷凍-解凍循環(huán)會(huì)加劇由脂質(zhì)氧化和蛋白氧化誘發(fā)的蛋白質(zhì)變性，這些蛋白的變性可能與下列因素有關(guān)，包括Ca2+-ATP酶活性的下降、蛋白質(zhì)的氧化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[1]。Sriket等[3]已經(jīng)證實(shí)冷凍-解凍會(huì)引起魚(yú)肉組織破壞、蛋白質(zhì)變性和肌肉纖維的損傷。Turhan等[4]發(fā)現(xiàn)隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，鰹魚(yú)和鮭魚(yú)魚(yú)片內(nèi)的總鐵和血紅素鐵的含量均明顯下降。Benjakul等[5]指出冷凍-解凍循環(huán)影響了鯰魚(yú)魚(yú)片的蛋白質(zhì)理化和生物化學(xué)特性。

冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)對(duì)魚(yú)肉質(zhì)量方面的研究主要集中在對(duì)魚(yú)肉品質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化方面，而在凍融次數(shù)對(duì)魚(yú)肉蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性影響方面的研究尚不深入。因此，本研究以鏡鯉魚(yú)為原料，探究冷凍-解凍循環(huán)對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性變化的影響，為冷凍-解凍循環(huán)引起魚(yú)肉品質(zhì)下降機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鏡鯉魚(yú)（約1 kg） 哈爾濱地利生鮮超市。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鎂、甘氨酸、尿素（均為分析純） 太倉(cāng)市億鑫化工有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid，EGTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydrixtmethyl)aminomethane，Tris） 上海譜振生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DTNB）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid，TNBS）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-104型精密電子天平、DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器設(shè)備（上海）有限公司；JD500-2電子天平鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；UT-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)翱藝儀器（上海）有限公司；GL-21M冷凍離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；Malvern激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；圓二色光譜（circular dichroism，CD）儀英國(guó)應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 原料肉的處理

新鮮鏡鯉魚(yú)在0～4 ℃條件下（冷庫(kù)中）經(jīng)擊暈、宰殺后去除魚(yú)鱗、內(nèi)臟、魚(yú)骨、魚(yú)鰭和魚(yú)皮，隨后置于在4 ℃的冰箱中至尸僵，然后對(duì)鏡鯉魚(yú)肉進(jìn)行處理。選取尸僵后鏡鯉魚(yú)的背部肉制成3 cm×3 cm×1 cm的肉塊，混勻。將所有切好的肉塊放于-25 ℃冰箱中進(jìn)行冷凍，7 d為一個(gè)凍結(jié)周期，隨后取出置于4 ℃條件下解凍，直至中心溫度達(dá)到0～4 ℃，即第1次冷凍-解凍過(guò)程完成。隨后依次完成3、5 次冷凍-解凍后備用。

1.3.2 魚(yú)肉肌原纖維蛋白的提取

參考Xiong Youling L.等[6]的方法進(jìn)行鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的提取。鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的提取過(guò)程在4 ℃條件下操作，提取的肌原纖維蛋白放置于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3.3 蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

選擇雙縮脲法進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=0.047 9x-0.006 1（R2=0.999 8）。

1.3.4 鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白功能特性指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 溶解度的測(cè)定

參考A?ón等[7]的方法進(jìn)行溶解度的測(cè)定，并在此基礎(chǔ)上稍作修改。吸取5 mL肌原纖維蛋白溶液（1 mg/mL）放入離心管中，10 000×g離心20 min，收集上清液并通過(guò)雙縮脲法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL），該上清液蛋白質(zhì)量濃度與離心前蛋白原始質(zhì)量濃度的比值即為蛋白的溶解度。

1.3.4.2 乳化性的測(cè)定

根據(jù)Pearce等[8]的方法，進(jìn)行鯉魚(yú)肌原纖維蛋白勻漿液的制備和乳化性的測(cè)定。肌原纖維蛋白勻漿液的乳化活性（emulsification activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsification stability index，ESI）分別按公式（1）、（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：A0、A10分別為乳狀液0、10 min時(shí)在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（20%）；ρ為樣品初始蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.4.3 δ-電勢(shì)的測(cè)定

將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L、pH 7.0）稀釋至相同質(zhì)量濃度（1 mg/mL），注入到彎曲的毛細(xì)管樣品池內(nèi)，使用激光粒度儀在常溫條件下測(cè)定其δ-電勢(shì)。

1.3.5 鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)變化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.5.1 巰基含量的測(cè)定

參考Xia Xiufang等[9]的方法進(jìn)行活性巰基含量的測(cè)定。取1 mL肌原纖維蛋白溶液（2 mg/mL）用8 mL Tris-甘氨酸溶液（pH 8，每升中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g乙二胺四乙酸）處理，然后經(jīng)均質(zhì)和離心（10 000 r/min、15 min）除去不溶性蛋白。取4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑反應(yīng)（用pH 8.0 Tris-甘氨酸緩沖液配制，含有4 mg/mL DTNB），空白中含有4.5 mL pH 8.0的Tris-甘氨酸緩沖液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，反應(yīng)30 min，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

參考Ellman[10]的方法進(jìn)行總巰基含量的測(cè)定。取1 mL 2 mg/mL肌原纖維蛋白溶液加入離心管中，加入8 mL Tris-甘氨酸溶液（pH 8.0，每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g乙二胺四乙酸、8 mol尿素），混勻后離心（10 000 r/min、15 min），收集上清液。取4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑反應(yīng)，30 min后使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，被溶解的蛋白質(zhì)量濃度使用雙縮脲法測(cè)定。

1.3.5.2 自由氨基酸含量的測(cè)定

自由氨基酸含量的測(cè)定參考Adler-Nissen等[11]的方法。用0.21 mol/L pH 8.2磷酸鹽緩沖液（含0.1 g/L SDS）將蛋白質(zhì)溶液稀釋到0.1 mg/mL，然后取0.25 mL的蛋白溶液與2 mL 0.01g/L TNBS溶液在50 ℃條件下避光水浴1 h，加入4.0 mL 0.1 mol/L HCl終止反應(yīng)?；旌先芤涸谑覝貤l件平衡30 min后，在340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。以L-亮氨酸在蛋白質(zhì)中的含量表征自由氨基酸的含量。

1.3.5.3 二聚酪氨酸含量的測(cè)定

參考Davies等[12]的方法進(jìn)行二聚酪氨酸含量的測(cè)定，并稍作修改。取2 mg/mL肌原纖維蛋白溶液注入熒光比色杯中，使用F-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)為325 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420 nm，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬均為5 nm。上清液的蛋白質(zhì)量濃度（2 mg/mL）在540 nm波長(zhǎng)處采用雙縮脲法測(cè)定，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用測(cè)得的熒光強(qiáng)度除以蛋白質(zhì)量濃度（2 mg/mL）得到相對(duì)熒光值表征二聚酪氨酸含量。

1.3.5.4 表面疏水性的測(cè)定

表面疏水性使用熒光探針ANS法進(jìn)行測(cè)定（ANS是一種疏水性探針，非極性環(huán)境有很好的熒光性）。分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L肌原纖維蛋白溶液，吸取每個(gè)濃度梯度的蛋白溶液5 mL，分別與25 μL 8 mmol/L ANS溶液（溶劑為pH 6.25 0.1 mol/L KH2PO4緩沖液）混合，室溫避光反應(yīng)20 min。隨后將樣品注入寬度為10 mm的熒光比色杯中，利用F-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度。測(cè)量條件：激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，狹縫寬度10 nm，在室溫（20 ℃）下測(cè)定。以熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即代表蛋白的表面疏水性。

1.3.5.5 α-螺旋含量的測(cè)定

參考Liu Qian等[13]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的測(cè)定。配制0.2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，注入1 mm寬的CD石英比色杯中，使用CD儀進(jìn)行光譜掃描。掃描速度100 nm/min，響應(yīng)時(shí)間25 s，縫寬1.0 nm，光譜掃描范圍200～260 nm。用平均摩爾橢圓率[θ]/（（deg·cm2）/dmol）來(lái)表示圓二色性，數(shù)據(jù)處理通過(guò)Yang’s方法計(jì)算蛋白質(zhì)α-螺旋的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。用Statistix 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)Turkey test程序?qū)ζ骄鶖?shù)之間的差異顯著性進(jìn)行分析，并用Sigmaplot 11.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍-解凍循環(huán)對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白功能特性的影響

2.1.1 對(duì)蛋白質(zhì)溶解度和δ-電勢(shì)的影響

圖1 反復(fù)冷凍-解凍對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白溶解度和δ-電勢(shì)的影響Fig. 1 Influence of freeze-thaw cycles on solubility and δ-potential of myofibrillar protein from mirror carp

溶解度是與蛋白質(zhì)功能性有關(guān)的一個(gè)重要指標(biāo)，能夠直接反映出蛋白質(zhì)變性和聚集的變化[14]。從圖1中可以看出，隨著凍融次數(shù)的增加，鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的溶解度顯著下降（P＜0.05）。新鮮肉樣的蛋白溶解度為81.87%，經(jīng)過(guò)1、3、5 次凍融循環(huán)后，蛋白的溶解度分別降低至75.80%、72.47%、62.85%。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融后肌原纖維蛋白溶解度降低，這可能是因?yàn)榧≡w維蛋白屬于鹽溶性蛋白，蛋白質(zhì)分子能夠通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵連接形成較多的高分子聚集物[15]，導(dǎo)致蛋白溶解度下降。反復(fù)冷凍-解凍造成肉中水分子形成冰晶，導(dǎo)致組織細(xì)胞內(nèi)尚未凍結(jié)的細(xì)胞液濃縮，細(xì)胞液中溶劑及金屬鹽離子濃度增大。離子強(qiáng)度增大造成蛋白質(zhì)氧化加速，引起蛋白質(zhì)分子解折疊，疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，促使蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)形成聚集和沉淀，故肌原纖維蛋白溶解度下降。此外，氧化還會(huì)促使巰基基團(tuán)相互作用形成更多的二硫鍵，蛋白質(zhì)聚集程度增大，降低了蛋白的溶解度。Sriket等[3]發(fā)現(xiàn)蝦肉蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加而降低，凍融5 次后黑蝦、白蝦的蛋白溶解度分別降低了10.75%和12.82%。Srikar等[16]也曾報(bào)道粉紅鱸魚(yú)蛋白在凍藏過(guò)程中溶解度下降。

從圖1中可以看出，新鮮肉樣蛋白的δ-電勢(shì)為-47.00 mV，而隨著冷凍-解凍次數(shù)的增加，蛋白的δ-電勢(shì)顯著增加（P＜0.05），當(dāng)冷凍-解凍5 次后，δ-電勢(shì)達(dá)到最高，為-15.67 mV。電勢(shì)絕對(duì)值降低即蛋白質(zhì)分子間的斥力減弱，同時(shí)蛋白質(zhì)分子間聚集的機(jī)率增大。鏡鯉魚(yú)經(jīng)過(guò)1 次和3 次凍融循環(huán)后δ-電勢(shì)差異不顯著（P＞0.05）。蛋白質(zhì)溶液中主要含有帶正電荷的組氨酸、精氨酸和賴氨酸，帶負(fù)電荷的谷氨酸和天冬氨酸[17]。δ-電勢(shì)的顯著上升說(shuō)明在反復(fù)凍融過(guò)程中蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集形成大分子，使得—COOH和—NH2的數(shù)目減少，溶液的極性降低，電荷密度減小。這也說(shuō)明了反復(fù)凍融過(guò)程引起了大分子的聚集從而降低了蛋白質(zhì)的溶解性。Mohan等[18]在研究南亞野鯪蛋白質(zhì)的功能特性時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白溶解度下降。

2.1.2 對(duì)蛋白質(zhì)乳化特性的影響

圖2 反復(fù)冷凍-解凍對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白乳化性的影響Fig. 2 Influence of freeze-thaw cycles on emulsifying properties of myofibrillar protein from mirror carp

蛋白質(zhì)的乳化特性可用來(lái)反映蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與脂肪之間的交聯(lián)能力。通常用EAI和ESI表示乳化能力的大小。從圖2可以看出，鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的EAI隨著冷凍-解凍次數(shù)的增加而降低。其中，新鮮樣品的EAI最高，乳化性最高，為31.68 m2/g。與新鮮樣品相比，凍融1 次之后EAI降低了2.87%，但差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明在初期冷凍-解凍過(guò)程中，冰晶的形成和升華還未對(duì)肌肉細(xì)胞造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷，此時(shí)蛋白發(fā)生輕微氧化，吸附在界面膜上的蛋白質(zhì)仍然較穩(wěn)定。與凍融循環(huán)1 次相比，經(jīng)過(guò)3 次凍融循環(huán)后EAI下降至26.73 m2/g，下降速度明顯增大，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)的變性程度也增大。凍融到第5次，EAI急劇下降至20.67 m2/g，表明經(jīng)過(guò)5 次冷凍-解凍過(guò)程后的鏡鯉魚(yú)肌肉細(xì)胞機(jī)械損傷極其嚴(yán)重，蛋白變性劇烈，肌球蛋白的交聯(lián)程度增大，從而使蛋白喪失了表面吸附脂肪顆粒的能力。EAI指蛋白質(zhì)在形成乳狀液時(shí)迅速吸附在水-油界面上，防止絮凝和聚結(jié)的能力[19]。隨著鏡鯉魚(yú)凍融次數(shù)的增加，蛋白發(fā)生氧化變性，產(chǎn)生大分子蛋白聚集體，因此能夠用來(lái)作為表面活性劑的蛋白分子變少，導(dǎo)致蛋白分子表面吸附脂肪顆粒的靈活性下降，故EAI下降[20]。

ESI是反映蛋白質(zhì)保持乳化體系中油水界面穩(wěn)定狀況的重要指標(biāo)。如圖2所示，反復(fù)冷凍-解凍后，鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的ESI顯著下降（P＜0.05），樣品凍融的次數(shù)越多，蛋白乳化液的穩(wěn)定性越差。與新鮮樣品相比，第5次解凍后鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的ESI由51.57%下降至34.83%。反復(fù)冷凍-解凍阻礙了蛋白形成穩(wěn)定的界面膜，蛋白與脂肪間交聯(lián)能力下降，進(jìn)而影響了蛋白的乳化能力。并且被用作表面活性劑的有效蛋白分子也不再形成穩(wěn)定的界面蛋白膜，故蛋白ESI下降，表現(xiàn)為鏡鯉魚(yú)背部肉肌原纖維蛋白EAI和ESI均降低。郭延娜[21]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍和解凍過(guò)程會(huì)造成豬肉肌原纖維蛋白EAI和ESI的下降，與本研究結(jié)果趨勢(shì)一致。此外，本研究中蛋白乳化特性的降低趨勢(shì)也與表面疏水性的上升和溶解性的下降趨勢(shì)一致。隨著冷凍-解凍次數(shù)的增加，魚(yú)肉蛋白的變性程度增大，蛋白的表面疏水性增加，促使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子間的相互作用增強(qiáng)聚集形成大分子蛋白，蛋白溶解度隨之降低，用于降低界面膜表面張力的乳化液微粒直徑增大，故蛋白的乳化作用降低。

2.2 冷凍-解凍循環(huán)對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

2.2.1 對(duì)蛋白質(zhì)巰基含量的影響

圖3 反復(fù)冷凍-解凍對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig. 3 Influence of freeze-thaw cycles on sulfhydryl content of mirror carp myofibrillar protein

總巰基是指蛋白質(zhì)分子的所有巰基，它包括位于蛋白質(zhì)分子表面的活性巰基以及包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基。活性巰基是指暴露于蛋白質(zhì)分子表面的巰基。如圖3所示，隨著凍融次數(shù)的增加，總巰基和活性巰基的含量均顯著降低（P＜0.05）。新鮮魚(yú)肉蛋白的活性巰基和總巰基含量分別為84.33 μmol/g和98.93 μmol/g。冷凍-解凍5 次后分別下降到69.10 μmol/g和75.40 μmol/g，分別下降了18.06%和23.78%?？値€基和活性巰基含量的減少是由于巰基的氧化造成多肽內(nèi)部或多肽間形成二硫鍵，或是巰基被進(jìn)一步氧化成磺酸類(lèi)或其他氧化產(chǎn)物，引起蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚合、交聯(lián)，導(dǎo)致巰基含量降低，同時(shí)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。此外，巰基含量的變化與α-螺旋含量及蛋白溶解度的降低也相關(guān)。Wu Shengjun等[14]也發(fā)現(xiàn)在冷凍貯存過(guò)程中，氧化反應(yīng)造成花鱸魚(yú)的肌原纖維蛋白巰基含量逐漸降低。反復(fù)凍融過(guò)程中，冰晶逐漸增長(zhǎng)，易刺破細(xì)胞促使汁液逐漸外溢，蛋白質(zhì)周?chē)磧鼋Y(jié)溶液的粒子濃度繼續(xù)增加，促使蛋白質(zhì)變性加速；因此，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化，導(dǎo)致巰基基團(tuán)含量發(fā)生改變[22]。Benjakul等[23]研究發(fā)現(xiàn)，鰭魚(yú)經(jīng)過(guò)冷凍-解凍循環(huán)后，其肌肉中表面巰基含量下降，而總巰基含量無(wú)顯著性變化，這說(shuō)明凍藏引起蛋白質(zhì)巰基含量的變化可能還受肌肉類(lèi)型的影響。

2.2.2 對(duì)蛋白質(zhì)自由氨基酸、二聚酪氨酸含量和表面疏水性的影響

圖4 反復(fù)冷凍-解凍對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白自由氨基酸、二聚酪氨酸含量和表面疏水性的影響Fig. 4 Influence of freeze-thaw cycles on free amino acids, dityrosine content and surface hydrophobicity of mirror carp myofibrillar protein

肌原纖維蛋白的自由氨基酸含量通常用來(lái)表征賴氨酸側(cè)鏈的變化情況[24]，可側(cè)面反映蛋白的結(jié)構(gòu)變化及其氧化變性程度。從圖4可以看出，新鮮肉樣蛋白的自由氨基酸含量為96.27 μmol/g，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融1、3、5 次后分別下降了7.43%、12.96%和17.43%。在冷凍貯藏期間，肉蛋白的氧化使賴氨酸殘基上的ε-NH2通過(guò)脫氨基作用很容易轉(zhuǎn)化為羰基，這些羰基衍生物隨即與—NH2反應(yīng)，從而進(jìn)一步降低游離氨基酸的含量[25]。Xia Xiufang等[9]報(bào)道冷凍-解凍循環(huán)加速了蛋白的氧化，從而產(chǎn)生了較高含量的羰基。由于自由氨基酸含量是在SDS存在的情況下測(cè)定的，SDS能破壞通過(guò)非共價(jià)鍵連接的聚合物；因此，自由氨基酸含量的下降可能由賴氨酸的ε-NH2與羰基衍生物之間的一些共價(jià)鍵被破壞引起的，而這些賴氨酸和羰基衍生物是由冷凍-解凍過(guò)程中發(fā)生的蛋白氧化作用產(chǎn)生。

二聚酪氨酸是兩個(gè)酪氨?；鶊F(tuán)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生的，這兩個(gè)酪氨?；鶊F(tuán)的位置可位于兩個(gè)不同蛋白質(zhì)側(cè)鏈上，也可以位于相同蛋白質(zhì)側(cè)鏈的兩個(gè)不同的位點(diǎn)上[26]。酪氨酸的含量也常被用來(lái)反映蛋白的氧化程度。反復(fù)冷凍-解凍對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響如圖4所示，隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，二聚酪氨酸的含量逐漸增大，相對(duì)熒光值從最初的19.64增加到了27.16。這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)多次冷凍-解凍循環(huán)后蛋白發(fā)生氧化，氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)艿阶杂苫牟粩喙簦饾u形成越來(lái)越多的酪氨酸殘基和酪胺酰胺自由基，經(jīng)過(guò)異構(gòu)化和烯醇化作用后生成了二酪氨酸[27]。

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基分布數(shù)量的一個(gè)重要指標(biāo)[28]，可以用它來(lái)反映蛋白質(zhì)的變性程度，表面疏水性越高說(shuō)明蛋白變性程度越大[29]。如圖4所示，新鮮魚(yú)肉的肌原纖維蛋白表面疏水性為42.67，冷凍-解凍1 次后，鯉魚(yú)脊背肉肌原纖維蛋白表面疏水性增加了7.27%，但差異不顯著（P＞0.05），而經(jīng)過(guò)5 次的冷凍-解凍循環(huán)后，其表面疏水性增加到58.50，增加了37.10% （P＜0.05）。表面疏水性增加說(shuō)明肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化，形成了異于天然結(jié)構(gòu)的狀態(tài)[30]，埋藏在蛋白質(zhì)空間構(gòu)象內(nèi)部的疏水性氨基酸（如色氨酸和苯丙氨酸）殘基暴露。反復(fù)進(jìn)行的冷凍-解凍過(guò)程促使蛋白質(zhì)變性，為熒光探針ANS提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)，故凍融循環(huán)次數(shù)的增加使得肌原纖維蛋白表面疏水性的含量不斷增加。Korzeniowska等[31]在研究?jī)鋈谔幚韺?duì)太平洋鱈魚(yú)天然肌動(dòng)蛋白的理化性質(zhì)的影響中發(fā)現(xiàn)，凍融循環(huán)后蛋白的表面疏水性顯著增加，他認(rèn)為肌球蛋白頭部的變化引起了疏水性基團(tuán)的暴露。Sriket等[3]研究發(fā)現(xiàn)黑虎蝦和白虎蝦經(jīng)過(guò)反復(fù)冷凍-解凍后，其蛋白表面疏水性增加，5 次循環(huán)后分別增加了21.9%和37.9%。Careche等[32]在研究?jī)霾仉u肉時(shí)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果，他們認(rèn)為凍藏雞肉蛋白表面疏水性的增加可能是肌肉蛋白在凍藏過(guò)程中蛋白氧化后輕微變性伸展導(dǎo)致的。此外，蛋白質(zhì)的表面疏水性還能夠側(cè)面反映蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，隨凍融次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊和相互交聯(lián)，故進(jìn)一步印證蛋白溶解度的降低和蛋白穩(wěn)定性的下降。本研究中，經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白表面疏水性的增加與溶解度降低的趨勢(shì)是一致的。

2.2.3 α-螺旋含量的變化

CD圖譜可用來(lái)表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，其中α-螺旋是蛋白質(zhì)中最典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)。肌原纖維蛋白的CD圖譜通常在波長(zhǎng)208 nm和222 nm處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰，這兩個(gè)特征峰即代表肌球蛋白尾部所富含的α-螺旋結(jié)構(gòu)。未經(jīng)冷凍處理及經(jīng)過(guò)多次冷凍-解凍后鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白的CD圖譜及α-螺旋含量如圖5所示?？梢钥闯?，隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，魚(yú)肉蛋白的CD曲線下移，α-螺旋含量下降。凍融循環(huán)1 次后，α-螺旋含量從最初的57.58%下降至55.15%，經(jīng)過(guò)3 次和5 次凍融循環(huán)后，α-螺旋含量分別下降了8.67%和15.09%。這意味著隨冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)不斷被破壞，部分α-螺旋結(jié)構(gòu)喪失。Jia Na等[33]也曾報(bào)道過(guò)冷凍-解凍處理會(huì)破壞豬肉肌原纖維蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致其含量下降。α-螺旋結(jié)構(gòu)主要依靠羰基氧（—CO）和多肽鏈的亞氨基氫（—NH—）之間的氫鍵來(lái)維系[34]。而這些氫鍵很可能會(huì)受到冷凍或凍藏過(guò)程中物理效應(yīng)的干擾而被破壞，如水分遷移、冰重結(jié)晶以及蛋白質(zhì)遭受的機(jī)械損傷等[24]。此外，蛋白質(zhì)在凍藏過(guò)程中的加速氧化是肌原纖維蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)破壞的另一個(gè)原因。Sun Weizheng等[35]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)受到氧化會(huì)降低α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

圖5 反復(fù)冷凍-解凍對(duì)鏡鯉魚(yú)肌原纖維蛋白CD圖譜的影響Fig. 5 Influence of freeze-thaw cycles on circular dichroism spectrum of mirror carp myofibrillar protein

3 結(jié) 論

鏡鯉魚(yú)經(jīng)過(guò)反復(fù)冷凍-解凍循環(huán)后，蛋白質(zhì)的乳化特性和溶解性降低，δ-電勢(shì)、二聚酪氨酸含量、表面疏水性升高，巰基、自由氨基酸和α-螺旋含量下降。冷凍解凍循環(huán)過(guò)程中冰晶的長(zhǎng)大和重結(jié)晶破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，降低了蛋白質(zhì)的功能特性。因此鏡鯉魚(yú)在運(yùn)輸、凍藏過(guò)程中應(yīng)防止溫度波動(dòng)，以維持蛋白質(zhì)特有的結(jié)構(gòu)，保持其良好的功能性質(zhì)。