BCL2-938C>A基因多態(tài)性與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病危險(xiǎn)度的相關(guān)性研究*

黃體龍，李曾麗，桑寶華，雷慶齡，宋春艷，楊春會(huì)，林云碧，呂 瑜，田 新，楊躍煌

(云南省昆明市兒童醫(yī)院血液科 650228)

兒童血液系統(tǒng)惡性腫瘤以急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)最常見，每年發(fā)病率3/10萬(wàn)～4/10萬(wàn)，多見于學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童。兒童ALL分低、中、高危組，不同危險(xiǎn)度ALL的治療強(qiáng)度不同、預(yù)后不同。危險(xiǎn)度分級(jí)由多種預(yù)后危險(xiǎn)因素綜合評(píng)估。隨著危險(xiǎn)度分組的不斷精確和治療方案的不斷改進(jìn)，兒童ALL的治愈率在近半個(gè)世紀(jì)來(lái)得到了顯著的提高，目前化療可以使兒童ALL的5年總生存率(OS)超過(guò)80%[1-2]。然而，長(zhǎng)期化療會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，尤其對(duì)高?；颊叨?，高強(qiáng)度的化療不良反應(yīng)更加嚴(yán)重[3]。因此，不斷發(fā)掘新的預(yù)后因素、進(jìn)一步精確危險(xiǎn)度分級(jí)，制定更加合理有效的化療方案是提高ALL患兒治愈率，減少不良反應(yīng)的關(guān)鍵。

1984年TSUJIMOTO等首次在濾泡性淋巴瘤患者的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)位于18號(hào)和14 號(hào)染色體(t14；18)易位連接處的BCL2基因。BCL2基因能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗細(xì)胞凋亡[4]。BCL2基因位于18號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶(18q21)，含3個(gè)外顯子和2個(gè)啟動(dòng)子，其編碼產(chǎn)物為1個(gè)由239個(gè)氨基酸組成的膜蛋白[5]。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道BCL2-938 C>A與癌癥易感性和預(yù)后相關(guān)[6-7]。本文旨在研究BCL2-938 C>A基因多態(tài)性在兒童ALL危險(xiǎn)度分組及治療分層中的意義，以使危險(xiǎn)度分組更加精確，進(jìn)一步提高兒童ALL的治愈率、減少過(guò)度治療及治療相關(guān)的不良反應(yīng)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2007年5月至2017年1月昆明市兒童醫(yī)院血液科診斷和治療的69例ALL兒童作為研究對(duì)象，69例患兒均按照細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分型(MICM)確診，并排除其他惡性腫瘤。按CCLG-ALL-2008方案進(jìn)行危險(xiǎn)度分組及治療[8]。本研究經(jīng)昆明市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且患兒家屬均簽署知情同意書。69例ALL患兒中，男42例，女27例；初診年齡0.8～12.9歲，平均為(5.8±3.2)歲；隨訪時(shí)間為2～117個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為15個(gè)月。其中低危組28例，中危組20例，高危組21例；B系急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)55例，急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL) 14例；55例患兒初發(fā)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)為0～50×109/L,14例在50×109/L以上。檢測(cè)到分子遺傳學(xué)改變有19例，包括5例Ph陽(yáng)性(其中1例BCR/ABL陽(yáng)性同時(shí)伴有IKZF1基因缺失)，9例TEL/AML1融合基因陽(yáng)性，3例SIL/TAL1陽(yáng)性，1例ASSI基因缺失，1例有MYC基因分離重排。復(fù)發(fā)8例，其中骨髓復(fù)發(fā)5例，髓外復(fù)發(fā)3例。死亡4例，放棄治療1例。

1.2儀器與試劑 PCR儀(美國(guó)ABI，GeneAmp?9700 384 Dual)；點(diǎn)樣儀(美國(guó)Agena，MassARRAY Nanodispenser RS1000)；質(zhì)譜分析儀(美國(guó)Agena，MassARRAY Compact System)。主要試劑：血液基因組提取試劑盒(中國(guó)天根Tiangen，DP319)；基因分型試劑盒(美國(guó)Agena，Complete Genotyping Reagent Kit，10148-2)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集與保存 留取初診ALL患兒的骨髓1.5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2基因組DNA的提取和SNPs分型

1.3.2.1從患兒EDTA抗凝骨髓1.5 mL中提取DNA，紫外分光光度法檢測(cè)OD260/OD280。

1.3.2.2PCR擴(kuò)增及純化目的基因檢測(cè)位點(diǎn)為rs2279115，根據(jù)SNP位點(diǎn)使用Agena公司的Assay Design 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)對(duì)合成的引物進(jìn)行質(zhì)檢。PCR反應(yīng)體系(5 μL)：去離子水1.8 μL，正向與反向引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL,10×buffer液0.5 μL，Mg2+0.4 μL，dNTP 0.1 μL，Hotstar 0.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共45個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。SAP酶消化非特異性產(chǎn)物。

1.3.2.3單堿基延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)體系(2 μL)：0.619 μL水，10×iplex buffer 0.2 μL,Terminator mix 0.2 μL,引物0.94 μL,單堿基延伸酶0.041 μL。循環(huán)條件：94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,52 ℃ 5 s,80 ℃ 5 s，內(nèi)部5個(gè)循環(huán),共45個(gè)循環(huán)，72 ℃ 3 min結(jié)束。在每個(gè)延伸反應(yīng)物加入樹脂35 min，脫鹽；將脫鹽后的樣品點(diǎn)樣在樣品靶上，自然結(jié)晶。

1.3.2.4MALDI-TOF-MS分型檢測(cè)時(shí)向延伸反應(yīng)產(chǎn)物的384孔板中加入16 μL三蒸餾水，在離心機(jī)中以2 000 r/min離心3 min；加入樹脂，在反向搖勻儀上做樹脂純化反應(yīng)35 min，脫鹽；反應(yīng)完成后，在離心機(jī)中以2 000 r/min離心3 min；將脫鹽后的樣品點(diǎn)樣在樣品靶上，自然結(jié)晶。用Typer 4.0軟件檢測(cè)質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖鑒定各樣本靶位點(diǎn)基因型。Mass Array?SNP檢測(cè)SNP多態(tài)性，用MALDI-TOF-MS檢測(cè)延伸產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量，分析軟件Mass Array TYPER 4.0 進(jìn)行基因分型分析。

2 結(jié) 果

2.1BCL2-938 C>A基因型分布特點(diǎn) C等位基因在這個(gè)樣本中的頻率為0.53，A等位基因的頻率為0.47，基因型分布情況符合Hardy-Weinberg平衡。69例ALL兒童BCL2-938 C>A基因型的檢測(cè)結(jié)果顯示，CC基因型有23例，CA型27例，AA型19例，見表1。

表1 BCL2-938C>A基因型與臨床危險(xiǎn)因素

2.2BCL2-938C>A基因型與臨床危險(xiǎn)因素相關(guān)性 ALL患兒預(yù)后與發(fā)病年齡(1～≤10歲或>10歲)、初發(fā)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(≥50×109/L)、免疫表型(T-ALL)、預(yù)后不良的分子遺傳學(xué)改變(BCR-ABL融合基因等)、早期治療反應(yīng)不良(D15及D33MRD未緩解)等危險(xiǎn)因素有關(guān)。本研究提示BCL2-938C>A基因型與兒童ALL危險(xiǎn)因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括患兒的發(fā)病年齡、免疫表型、分子遺傳學(xué)改變、初發(fā)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、早期治療反應(yīng)不良，見表1。

表2 BCL2-938基因型與不同危險(xiǎn)度ALL的相關(guān)性

2.3BCL2-938基因型多態(tài)性與ALL的危險(xiǎn)度相關(guān)性 不同BCL2-938基因型間ALL的危險(xiǎn)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)，見表1。CC基因型患兒的百分比在低危(14.3%)、中危(40.0%)、高危組(52.4%)中呈逐漸上升趨勢(shì)。攜帶CC基因型ALL患兒出現(xiàn)在中高危組的頻率較CA/AA基因型患兒高。CC基因型的ALL患兒比CA/AA基因型患兒有更高風(fēng)險(xiǎn)分布于中、高危組(P<0.05)，見表2。

3 討 論

兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的治療是一個(gè)漫長(zhǎng)且復(fù)雜的過(guò)程，包括早期誘導(dǎo)治療、鞏固治療和繼續(xù)治療3個(gè)階段。早期的誘導(dǎo)治療是為了減少腫瘤細(xì)胞的負(fù)荷并恢復(fù)骨髓正常的造血功能，是決定患兒能否獲得長(zhǎng)期無(wú)病生存的關(guān)鍵。鞏固治療的目的是進(jìn)一步清除誘導(dǎo)治療后殘留的白血病細(xì)胞。繼續(xù)治療包括再誘導(dǎo)治療及為期2～3年的維持治療，目的在于防止白血病在誘導(dǎo)、鞏固、緩解后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。在過(guò)去20年中，ALL兒童生存率得到了顯著改善，這歸功于危險(xiǎn)度分組的不斷完善及化療方案的不斷改進(jìn)。兒童ALL危險(xiǎn)度分組的不斷精確，得益于人們對(duì)ALL細(xì)胞遺傳學(xué)及其他生物學(xué)特征等遺傳相關(guān)預(yù)后因素的不斷發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)及利用[9]。兒童ALL分為低、中、高危險(xiǎn)度組，不同危險(xiǎn)度給予不同的治療強(qiáng)度[10]。低?；純和ǔｎA(yù)后較好，予以低強(qiáng)度的化療方案就可達(dá)到長(zhǎng)期無(wú)病生存，而相對(duì)預(yù)后較差的中高危組患兒需要更高強(qiáng)度的化療來(lái)避免復(fù)發(fā)。分層治療使得高?；颊呓邮芨鼜?qiáng)的治療以尋求長(zhǎng)期無(wú)病生存，讓不存在高危因素的患兒治療強(qiáng)度降低，從而避免過(guò)度治療、減少化療相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。

BCL2是在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和延遲細(xì)胞周期中起重要作用的抗凋亡蛋白[11]。目前BCL2基因啟動(dòng)子區(qū)域僅有1個(gè)SNP，其位于核苷酸-938位置(BCL2-938 C>A)。有研究表明，BCL2-938 C>A啟動(dòng)子多態(tài)性顯著影響了多種癌癥的BCL2基因啟動(dòng)子活性及BCL2的表達(dá)[12-13]。BCL2-938 C>A多態(tài)性與不同類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)不同，這取決于組織細(xì)胞的特異性。LIU等[14]發(fā)現(xiàn)BCL2-938 AA基因型與食管癌的易感性有關(guān)；LI等[15]的研究顯示BCL2-938 CC基因型會(huì)導(dǎo)致人群罹患食管癌及其癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)增加。有文獻(xiàn)[16]報(bào)道BCL2在成年ALL的誘導(dǎo)治療期間是一個(gè)潛在的治療反應(yīng)指標(biāo)。本文研究了BCL2-938 C>A多態(tài)性與ALL危險(xiǎn)度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與兒童ALL的危險(xiǎn)度分組密切相關(guān)，CC基因型ALL患兒出現(xiàn)在中高危組的頻率更高。此外，本文研究了BCL2-938 C>A基因多態(tài)性與目前兒童ALL常見的危險(xiǎn)因素相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)BCL2-938 C>A基因型與發(fā)病年齡、初發(fā)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、分子遺傳學(xué)改變、D15及D33 MRD等危險(xiǎn)因素?zé)o明顯相關(guān)性。本研究提示CC基因型可能是兒童ALL危險(xiǎn)分組的重要因素。

綜上所述，BCL2-938 C>A基因多態(tài)性與兒童ALL的危險(xiǎn)度分組密切相關(guān)，BCL2-938 CC基因型可能是兒童ALL重要的危險(xiǎn)因素。在兒童ALL中，BCL2-938 C>A基因多態(tài)性的表達(dá)可能有利于精確危險(xiǎn)度分組及進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。