地塞米松影響大鼠成骨細(xì)胞脂質(zhì)分化相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)觀察*

宋麗君,劉 軍,魏 波,郭偉雄，胡資兵,向 昊,孫 欣，彭智恒，孫杰聰,文琳釗

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學(xué)中心；2.骨科，廣東湛江 524001)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)被廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、炎癥性疾病的治療，遺憾的是伴隨激素的應(yīng)用產(chǎn)生了各種各樣的不良反應(yīng)。骨壞死是其中一種嚴(yán)重的并發(fā)癥[1-2]。長(zhǎng)期應(yīng)用GC可能導(dǎo)致高脂血癥，血清三酰甘油、膽固醇升高，同時(shí)它也可誘發(fā)骨髓脂肪細(xì)胞肥大、增生。大量臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明GC誘發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂存在于骨壞死的病理過(guò)程中[3-5]。成骨細(xì)胞是GC作用的靶組織之一，是維持骨質(zhì)平衡與代謝穩(wěn)定的主要結(jié)構(gòu)。適宜的GC水平在骨的發(fā)育與維持中起著相當(dāng)重要的作用。靶組織中細(xì)胞內(nèi)GC的濃度不僅依賴細(xì)胞外激素水平，同時(shí)也依賴于激素的局部代謝。GC的生物學(xué)活性受到11β-羥脫氫酶(11β-HSD)的調(diào)節(jié)，能夠催化無(wú)活性皮質(zhì)酮與活性皮質(zhì)醇相互轉(zhuǎn)換[6]。成骨細(xì)胞能夠活化非活性形式的GC，通過(guò)11β-HSD1 來(lái)調(diào)節(jié)激素的水平維持良好的內(nèi)環(huán)境。甘珀酸能夠抑制11β-HSD1的轉(zhuǎn)換活性。

本文觀察在應(yīng)用活性抑制劑甘珀酸前后，地塞米松(Dex)作用于成骨細(xì)胞后，對(duì)成骨細(xì)胞的成脂與成骨分化的標(biāo)志性基因及成骨細(xì)胞標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα、runx2、Col.1、OPG的表達(dá)，初步分析地塞米松對(duì)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚與基因表達(dá)異常之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 4月齡SD大鼠由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供。胰蛋白酶、aMEM、膠原酶(GIBCO)、小牛血清(Biological industries)、堿性磷酸酶試染色劑盒、堿性磷酸酶活性試劑盒(Sigma)， RT-PCR kit,RNA-Plus,PCR 熒光試劑(Gibco),甘珀酸(CBX，Sigma)。

1.2成骨細(xì)胞培養(yǎng)鑒定 拉頸脫臼處死SD大鼠，取出顱骨，去掉附著的軟組織，PBS液洗凈后，在aMEM培養(yǎng)基中剪成約1 mm3大小骨塊，以1 cm2密度種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3 mL含有20%胎牛血清的aMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中2 h，待骨植塊稍干涸粘于瓶底，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸沒(méi)于培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代(約12 d)，用相差貼壁法純化成骨細(xì)胞。堿性磷酸酶染色鑒定：在成骨細(xì)胞長(zhǎng)滿蓋玻片后，用4 ℃ 10%甲醛固定，蒸餾水沖洗，將ALP孵育液直接滴加到蓋玻片上，室溫下孵育30 min，在相差顯微鏡下觀察。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 成骨細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，按照所用地塞米松濃度分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組(加生理鹽水)，A組(Dex 1×10-8mol/L)，B組(Dex 1×10-7mol/L)，C組(Dex 1×10-6mol/L)，D組(Dex 1×10-8mol/L+CBX)，E組(Dex 1×10-7mol/L+CBX)，F(xiàn)組(Dex 1×10-6mol/L+CBX)，CBX劑量為8×10-7mol/L，所有組作用6 h。

1.4總RNA 提取及Real-time PCR分析 總mRNA提?。喊凑誖NA-Plus試劑盒(Gibco)說(shuō)明從成骨細(xì)胞提取總RNA。所得沉淀溶解于DEPC溶液，取2 μL稀釋至100 μL，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量及OD值。剩余部分存放于-80 ℃以備逆轉(zhuǎn)錄。

逆轉(zhuǎn)錄：取細(xì)胞RNA樣本，根據(jù)上述mRNA的含量計(jì)算1 μg mRNA所需的適量RNA體積，加入：5×g DNA Eraser Buffer 2 μL+gDNA Eraser 1 μL+適量DEPC水構(gòu)成10 μL體系，室溫下放置5 min，將上述反應(yīng)液10 μL加入：5×PrimeScript Buffer 4 μL+ PrimeScript?Enzyme 1 μL+RT Primer Mix 1 μL+DEPC水4 μL直至20 μL,反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃下保存。最終得到的cDNA放置于-20 ℃冰箱中保存以備下一步PCR反應(yīng)過(guò)程。

Real-time PCR:應(yīng)用LightCycler?480PCR反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)11β-HSD1,PPAR,C/EBPα,RUX2,C/EBP)α mRNA表達(dá)。β-actin作為內(nèi)參引物。反應(yīng)體系包含10 μL TaqMan通用PCR反應(yīng)液，2 μL引物,2 μL TaqMan探針及2 μL cDNA。 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。按照試劑盒說(shuō)明根據(jù)測(cè)得Ct值計(jì)算出≥Ct值，△Ct目的基因Ct-內(nèi)參Ct；△△Ct待測(cè)樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct；相對(duì)表達(dá)量=-△△Ct。引物：11-HSD1，正向：5′-CTCAGCTATGTGGTCCTGAGC-3′，反向： 5′-AATGGTGGAAAAGAACCCATC-3′；C/EBPα，正向：5′-GTCGGTGGATAAGAACAGCAAC-3′，反向：5′-CTGGTCAA CTCCAACACCTTCT-3′；PPARr，正向：5′-GT GGCTGCTATAATTTGCTGTG-3′，反向：5′-GGAGTT TTGGGAAGAGAAAGGT-3′；runx2，正向：5′-CCATAACGG TCTTCACAAATCC-3′，反向：5′-GCGGGACACCTACTCTCATACT-3′；β-Actin，正向：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC -3′，反向：5′-CCCATACCCACCATCACACC -3′。

2 結(jié) 果

2.1成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定 見(jiàn)圖1。

A：第二代成骨細(xì)胞(×40)；B：細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性

圖1成骨細(xì)胞分離鑒定

2.2成骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 油紅O染色顯示，地塞米松(1×10-7mol/L)作用后成骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在紅染的均勻顆粒,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有脂質(zhì)形成與積聚。見(jiàn)圖2。

A：(×40)；B：(×200)

圖2激素作用后成骨細(xì)胞油紅染色

表1 分離RNAs濃度及OD值

2.3mRNAs分析 所分離獲得的RNAOD值為1.7～2.0，表明RNA含量穩(wěn)定，可以用于下一步RNA分析(表1)。RT-PCR分析，當(dāng)?shù)厝姿捎傻蜐舛认蚋邼舛茸饔脮r(shí)，PPARγ,C/EBPα RNA表達(dá)上升， runx2表達(dá)下降，成骨細(xì)胞的標(biāo)志物OPG與Ⅰ型膠原表達(dá)無(wú)明顯改變；應(yīng)用11β-HSD1酶活性抑制劑CBX不能改變這種趨勢(shì)(圖3)。

PPARγ,C/EBPα RNA表達(dá)在應(yīng)用地塞米松后上升，A、B、C組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)用甘珀酸后表達(dá)仍呈上升趨勢(shì)，高低深度間仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，runx2表達(dá)下降。成骨性標(biāo)志基因表達(dá)變化各組間不顯著，OPG在激素組呈略下降趨勢(shì)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

骨壞死是伴隨糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的一種嚴(yán)重并發(fā)癥。迄今為止對(duì)于它們之間的關(guān)系與機(jī)制研究已開(kāi)展了大量研究工作。JONES等[7]研究認(rèn)為過(guò)量的糖皮質(zhì)激素可能誘發(fā)脂肪肝，引起脂肪栓塞阻塞骨的血管，并最終導(dǎo)致骨壞死。大量的臨床與基礎(chǔ)研究表明脂質(zhì)代謝紊亂存在于股骨頭壞死的病理過(guò)程中[8]。KAWAI等[4]認(rèn)為發(fā)生于股骨頭缺壞死的缺血性改變可能是非直接或者是繼發(fā)的改變，而不是一種原發(fā)的原因。接受激素治療的動(dòng)物表現(xiàn)出軟骨下骨區(qū)域骨細(xì)胞的脂肪壞死，以及與骨細(xì)胞脂肪沉積相平行的漸進(jìn)性的骨細(xì)胞變性。骨細(xì)胞脂肪變是骨壞死病理過(guò)程中脂質(zhì)代謝紊亂的一項(xiàng)重要機(jī)制。脂質(zhì)沉積可能發(fā)生在激素治療后的股骨頭的各系細(xì)胞。隨激素應(yīng)用時(shí)間延長(zhǎng)，脂質(zhì)沉積逐漸增加，并且融合成脂滴。細(xì)胞核受壓、邊集，細(xì)胞器功能受到干擾，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死[4,9]。這提示骨細(xì)胞的脂肪變性是股骨頭壞死的一項(xiàng)重要病理改變，是否這一改變的原因是由于成骨細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化(表型改變)？目前報(bào)道較少。成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶，OPG，Ⅰ型膠原是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志。本研究中作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用大劑量的糖皮質(zhì)激素時(shí)，成骨細(xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)積聚改變，成脂肪標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα表達(dá)顯著升高，而成骨性標(biāo)志基因runx2表現(xiàn)下降，這提示在皮質(zhì)激素誘發(fā)的成骨細(xì)胞脂質(zhì)變可能是由于細(xì)胞本身發(fā)生了表型異常所致。

11β-HSD1是一種NADPH依賴性酶主要起還原酶活性，在人轉(zhuǎn)換非活性皮質(zhì)酮為有活性的皮質(zhì)醇，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物則轉(zhuǎn)換11去氫皮質(zhì)酮為皮質(zhì)酮，從而擴(kuò)大了激素的作用。有研究認(rèn)為地塞米松不能被11β-HSD1轉(zhuǎn)換，僅僅上調(diào)其表達(dá)[10-11]。本文發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞受地塞米松作用后，出現(xiàn)明顯細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴形成。說(shuō)明糖皮質(zhì)激素能夠明顯誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚過(guò)程。而地塞米松能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)成脂分化基因，表現(xiàn)為PPARγ,C/EBPα隨激素濃度遞增上升，應(yīng)用皮質(zhì)激素活性抑制劑甘珀酸后這種表達(dá)增高的趨勢(shì)未被抑制，而影響成骨分化基因runx2則有下降趨勢(shì)。兩種情況下成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原與OPG表達(dá)未見(jiàn)顯著變化。由此提示地塞米松可能如文獻(xiàn)所述不需經(jīng)過(guò)11β-HSD1酶的活性轉(zhuǎn)換，而直接進(jìn)入細(xì)胞起作用。再者地塞米松抑制了該酶的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源性皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)換下降，不能有效促進(jìn)成骨，表現(xiàn)為膠原與OPG表達(dá)無(wú)上升改變。PPARγ是維持脂質(zhì)穩(wěn)定的重要核受體家族成員。體外研究提示潑尼松能夠打破SD大鼠runx2與PPARγ之間的平衡，破壞成骨與成脂的內(nèi)在穩(wěn)定，從而削弱成骨能力[9-10]。因此作者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素作用下成骨細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚可能是由于誘導(dǎo)了成脂分化性基因表達(dá)的結(jié)果，但這種脂質(zhì)調(diào)節(jié)異常的結(jié)果是否直接影響到了成骨細(xì)胞的功能與機(jī)制，還有待于更深入的研究以獲取充分證據(jù)。

當(dāng)SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞在體外受到人工合成的糖皮質(zhì)激素作用時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，成脂分化性基因表達(dá)增加，成骨相關(guān)基因表達(dá)下降，酶活性抑制劑不能有效影響這一趨勢(shì)，提示過(guò)量的人工合成皮質(zhì)激素可能通過(guò)改變了成脂分化性基因的表達(dá)而使細(xì)胞表型發(fā)生了改變，抑制了成骨性能，從而成為激素誘發(fā)的骨壞死的原因之一，但仍需更深入的研究來(lái)闡明詳細(xì)機(jī)制。