HPLC法測(cè)定獸用中藥散劑中非法添加苯丙酸諾龍的方法研究

吳昊 吳蕾 劉紅云

摘要 [目的]建立5種獸用中藥散劑中非法添加苯丙酸諾龍的高效液相色譜檢測(cè)方法。[方法]獸藥樣品經(jīng)甲醇超聲提取后離心進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析。以乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，采用反相高效液相色譜-紫外檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為241 nm。[結(jié)果]苯丙酸諾龍的線性范圍是1.0～50.0 mg/L，回收率為89.7% ～102.5%，方法的檢測(cè)限為1.0 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg。[結(jié)論]該方法的靈敏度高、精密度好、回收率高，適用于中獸藥中苯丙酸諾龍的快速檢測(cè)，為監(jiān)管部門查處非法添加提供檢測(cè)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 中獸藥;苯丙酸諾龍;高效液相色譜;非法添加

中圖分類號(hào) S859.79文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0160-03

Abstract [Objective]This experiment established a method for determination of nandrolone phenylpropionate in 5 kinds of veterinary traditional Chinese drugs by HPLC.[Method] Veterinary powder samples were chosen and extracted by methanol，then detected by HPLC.Acetonitrile and water as mobile phase，gradient elute; determination by reversed-phase high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，the wavelength was 241 nm.[Result] The linear range of nandrolone phenylpropionate was 1.0 to 50.0 mg/L.The recovery rate was between 89.7% -102.5%，the limit of detection（LOD）was 1.0 mg/kg and the limit of quantitation（LOQ）was 5.0 mg/kg.[Conclusion]The method has high sensitivity，good precision and high recovery rate，and is suitable for rapid detection of phenylpropionate in Chinese veterinary medicine，and provides a test basis for the regulatory authorities to investigate and deal with illegal addition.

Key words Veterinary traditional Chinese medicine; Nandrolone phenylpropionate;High performance liquid chromatography; Illegal addition

苯丙酸諾龍是一種蛋白同化激素，是具有環(huán)戊烷并多氫菲母核的甾體激素類藥物，具有蛋白同化作用[1]，在醫(yī)學(xué)上用于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷后的修復(fù)、再生障礙性貧血的治療及骨質(zhì)疏松癥的輔助治療，同時(shí)也具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、利于蛋白質(zhì)沉積的作用。該試驗(yàn)選取了5種中獸藥，有健胃散、肥豬散等，主要有催肥、開(kāi)胃、主治生長(zhǎng)遲緩等作用，若違規(guī)添加苯丙酸諾龍，利用其強(qiáng)的蛋白同化作用，可增強(qiáng)動(dòng)物食欲和提高飼料轉(zhuǎn)化率，但食用此類殘留有苯丙酸諾龍的動(dòng)物源性食品會(huì)造成男女性別特征的紊亂、總膽固醇升高、肝細(xì)胞癌、青少年兒童骨骼早閉后的身材矮小等，嚴(yán)重危害消費(fèi)者身心健康。因此該試驗(yàn)旨在建立中獸藥散劑中非法添加苯丙酸諾龍HPLC法的定性、定量檢查方法，為獸藥監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)[2-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。美國(guó)Agilent公司高效液相色譜儀，型號(hào)1260-Ⅱ，配四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、二極管陣列紫外檢測(cè)器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱; 十萬(wàn)分之一天平，德國(guó)賽多利斯，感量0.01 mg，型號(hào)BS21S;水浴超聲儀（HS10260D）;超純水機(jī)（Milli-Q? Millipore）;高速冷凍離心機(jī)（Hitachi CR 22G）。

1.1.2 主要試劑。

苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%，批號(hào)100004-200603，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;健胃散（石家莊九鼎動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)17020329）;肥豬散（阜陽(yáng)順昌牧業(yè)有限公司，批號(hào)20170901）;強(qiáng)壯散（安慶市柯曠動(dòng)物藥業(yè)，批號(hào)170901）;壯陽(yáng)散（合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)，批號(hào)20181218）;豬健散（亳州同欣生物科技有限公司，批號(hào)20161204）。甲醇、乙腈均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水，符合GB/T 6682 用水規(guī)定。

1.1.3 溶液配制。

1.1.3.1 對(duì)照品溶液的制備。精密稱取苯丙酸諾龍對(duì)照品100 mg于100 mL 容量瓶，加甲醇溶解，制成濃度為1 000 mg/L的儲(chǔ)備液，精密量取儲(chǔ)備液5 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成工作液。

1.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的制備。

精密量取“1.1.3.1”項(xiàng)下的儲(chǔ)備液，用甲醇依次稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱C18 150 mm×4.6 mm（eclipse Plus C18），粒徑5 μm，或者相當(dāng);柱溫35 ℃;流速1.0? mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)241 nm;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相見(jiàn)表1。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線。將苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次濃度從低到高，按上述色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)3次，按其所得峰面積的平均值與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 樣品處理。準(zhǔn)確稱取獸藥樣品2.0 g（精確至0.01 g），置于50? mL離心管中，準(zhǔn)確加入25 mL甲醇，加塞，振蕩1 min;再置于超聲儀中超聲25 min，放冷，3 500 r/min 離心10 min。精密量取上清液1 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，溶液過(guò)0.45 μm 微孔有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.2.4 空白溶液的制備? 準(zhǔn)確稱取經(jīng)檢測(cè)不含陽(yáng)性樣品的健胃散、肥豬散等樣品各2 g至50 mL離心管中，按“1.2.3”方法處理。

1.2.5 樣品回收率及精密度。準(zhǔn)確稱取獸藥樣品各2.0 g，分別加入適量苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品工作液， 制成2.5、5.0、7.5? mg/kg 的3種質(zhì)量濃度的陽(yáng)性樣品， 按“1.2.3”方法進(jìn)行處理，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加濃度做5個(gè)平行，計(jì)算平均回收率和精密度。

1.2.6 檢測(cè)限和定量限。在空白樣品中添加苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)溶液， 測(cè)得其保留時(shí)間處的響應(yīng)值與基線噪音值，計(jì)算信噪比，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯丙酸諾龍的液相色譜圖與保留時(shí)間 在選定的色譜條件下， 測(cè)得苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間約為7.9 min，見(jiàn)圖1;各陽(yáng)性添加樣品色譜圖見(jiàn)圖2～6，空白樣品色譜圖見(jiàn)圖7。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖8，線性方程為y=30.024x+25.267， 其中y代表峰面積，x代表苯丙酸諾龍標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（mg/L），相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，表明苯丙酸諾龍?jiān)?.0～50.0? mg/L線性關(guān)系良好。

2.3 樣品回收率和精密度 5種中獸藥樣品陽(yáng)性添加平均回收率在89.7%～102.5%，RSD在2.3%～3.5%。表明該方法精密度良好。

2.4 檢測(cè)限和定量限 在信噪比大于3的情況下，苯丙酸諾龍的檢測(cè)限為1.0? mg/kg，在信噪比大于10 的情況下苯丙酸諾龍的定量限為5.0? mg/kg。

3 討論

3.1 樣品處理 苯丙酸諾龍極性小，脂溶性強(qiáng)，不溶于水，可溶于乙醇、甲醇、正己烷等有機(jī)溶劑。因此，該試驗(yàn)在前處理中選擇了甲醇和乙腈為提取試劑，發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果較好，處理空白樣品時(shí)能較好地排除雜質(zhì)對(duì)主峰的干擾。除提取溶劑的選擇外，該試驗(yàn)還比較了處理步驟的不同，離心對(duì)樣品的影響，發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)過(guò)超聲并離心后干擾清除更徹底，因此確定了超聲并離心的處理步驟。

3.2 流動(dòng)相的選擇 如前所述，苯丙酸諾龍極性較小，出峰較遲，該試驗(yàn)選用乙腈-水和甲醇-水2種流動(dòng)相體系，采用不同比例做流動(dòng)相，并參考其他文獻(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用乙腈-水作為流動(dòng)相能把苯丙酸諾龍與飼料中的其他組分分離。當(dāng)選擇乙腈-水比例75∶25為初始比例時(shí)，陽(yáng)性添加樣品中的中藥成分出峰太多，對(duì)出峰時(shí)間為8 min左右的主峰干擾嚴(yán)重，因此直接提高有機(jī)相比例，確定初始比例乙腈-水為75∶25，并選擇表1中的梯度洗脫程序時(shí)，苯丙酸諾龍的保留時(shí)間適中，且與中獸藥樣品中的其他干擾雜質(zhì)分離效果佳，峰型好。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定5種中獸藥散劑中的苯丙酸諾龍含量的方法。試樣的前處理方法簡(jiǎn)便、快速，方法的靈敏度高、精密度好、回收率高，適用于中獸藥中苯丙酸諾龍的快速檢測(cè)，為監(jiān)管部門查處非法添加提供檢測(cè)依據(jù)。

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