施用石灰氮對(duì)煙株生長(zhǎng)和根際土壤微生物區(qū)系的影響

樊祖清，李紅麗，蘆阿虔，王 巖，段宏群，程仲記

(1.鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南省洛陽(yáng)市煙草公司，河南 洛陽(yáng) 471000； 3.中國(guó)煙草總公司河南省公司，河南 鄭州 450000)

由于長(zhǎng)期連作、施用化肥和農(nóng)藥，煙草土傳病害如黑脛病、根結(jié)線蟲(chóng)病等發(fā)生越來(lái)越重，且危害面積越來(lái)越大。黑脛病(The black shank)是煙草種植過(guò)程中普遍發(fā)生的一種土傳性真菌病害[1]。根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne)是一種雜食性植物病原線蟲(chóng)，寄主范圍廣泛，包括茄果類、豆類及蘿卜等蔬菜，還可傳播真菌和細(xì)菌性病害，主要危害作物根部，致使作物結(jié)果少、產(chǎn)量低，嚴(yán)重的會(huì)造成植株提早死亡[2-5]。在河南省煙葉種植區(qū)，煙草土傳病害主要是黑脛病和根結(jié)線蟲(chóng)病。前者易發(fā)生在高溫高濕環(huán)境下，后者主要在干旱條件下發(fā)生。土傳病害發(fā)生的最直接表現(xiàn)是土壤微生物中病原微生物增多，微生態(tài)失衡[6-7]。因此，安全高效地減少土壤中病原微生物、改善土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)是解決土傳病害發(fā)生的一項(xiàng)重要措施。

石灰氮作為肥料使用已有超過(guò)百年的歷史，由于其本身以及轉(zhuǎn)化過(guò)程的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物都會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生毒害作用，曾一度難以推廣[8]。然而，隨著技術(shù)的革新和研究的深入，石灰氮作為一種肥藥兩用的土壤凈化劑再一次進(jìn)入農(nóng)業(yè)使用范圍[9]。石灰氮在土壤中與水發(fā)生反應(yīng)，生成了氫氧化鈣和氰氨，氰氨水解形成尿素，最終分解成氨，直接被植物吸收[10]。早在20世紀(jì)90年代末，朱本岳等[11]研究了石灰氮對(duì)大白菜根腫病的防治效果。近年來(lái)，侯茂林[12]、劉志明等[13]和許華等[14]等研究證實(shí)，石灰氮對(duì)瓜果蔬菜的根結(jié)線蟲(chóng)病具有很好的防治效果，對(duì)土壤的理化性狀也有很大影響。這些試驗(yàn)探究了石灰氮對(duì)土傳病害的防治效應(yīng)，但對(duì)其降低土傳病害發(fā)生的具體原因并未做出研究。鑒于此，在煙草種植起壟階段(移栽前)向煙田中施加石灰氮，并采用薄膜覆蓋，通過(guò)與常規(guī)施肥對(duì)比，研究施用石灰氮對(duì)煙株生長(zhǎng)過(guò)程及煙株根際土壤微生物區(qū)系的影響，為煙草土傳病害的有效防控和煙草生產(chǎn)中石灰氮的施用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選擇在洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣黑脛病和根結(jié)線蟲(chóng)病多發(fā)的鹽鎮(zhèn)鄉(xiāng)煙葉種植區(qū)進(jìn)行。該地塊連續(xù)3 a植煙，土壤為紅黏土。有機(jī)質(zhì)含量23.06 g/kg，全氮含量1.25 g/kg，堿解氮含量70.01 mg/kg，有效磷含量36.36 mg/kg，速效鉀含量188.88 mg/kg，pH值為6.96。供試烤煙品種為豫煙6號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置處理(T)和對(duì)照(C)。處理T煙田的氮源由石灰氮提供，石灰氮用量為150 kg/hm2，在煙草移栽前25 d條施，澆水后覆蓋地膜；對(duì)照C煙田正常施肥。處理T與對(duì)照C煙田施用的氮(N)、磷(P2O5)、鉀(K2O)量均分別為45、90、135 kg/hm2。

1.3 樣品采集、測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 樣品采集 在煙草移栽前(施用石灰氮之前)、團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期和成熟期按5點(diǎn)法采集煙株根際土樣。土壤樣品預(yù)處理：取一部分新鮮土壤裝離心管后冷凍保存以備進(jìn)行土壤微生物基因測(cè)序；另取一部分置于4 ℃冰箱冷藏以備檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)微生物數(shù)量。

1.3.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量 土壤微生物數(shù)量采用涂布平板法測(cè)定，細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定[15]。為了更好地比較不同時(shí)期的土壤微生物數(shù)量，在計(jì)算時(shí)去除土壤中的水分，以干土表示。

1.3.3 宏基因組微生物測(cè)序 土壤冷凍樣品寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行宏基因組微生物(包括細(xì)菌和真菌)測(cè)序，由于放線菌門隸屬于細(xì)菌界，故宏基因組不單獨(dú)測(cè)定放線菌門。測(cè)序結(jié)果用Alpha多樣性、細(xì)菌(真菌)群落結(jié)構(gòu)、Betta多樣性表示[16]。

1.3.4 煙株農(nóng)藝性狀、病害發(fā)生情況 團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期測(cè)定煙株的有效葉數(shù)、株高、莖圍以及腰葉大小，成熟期調(diào)查烤煙黑脛病和根結(jié)線蟲(chóng)病的發(fā)病率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用石灰氮對(duì)煙株根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

由表1可知，從移栽前到團(tuán)棵期，處理T煙株根際土壤細(xì)菌數(shù)量減少87.0%，真菌數(shù)量減少89.8%，放線菌數(shù)量減少87.3%，這是由于石灰氮具有殺菌效果，殺滅了處理T煙田土壤中的大多數(shù)微生物；從團(tuán)棵期到旺長(zhǎng)期，處理T煙株根際土壤細(xì)菌和放線菌的數(shù)量分別增加171.9%、83.3%，真菌數(shù)量減少5.2%；從旺長(zhǎng)期到成熟期，根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌微生物的數(shù)量分別減少了52.9%、77.2%、56.8%。

從移栽前到團(tuán)棵期，對(duì)照C煙株根際土壤細(xì)菌數(shù)量減少4.9%，真菌數(shù)量減少82.1%，放線菌數(shù)量減少37.6%；從團(tuán)棵期到旺長(zhǎng)期，煙株根際土壤細(xì)菌和真菌的數(shù)量分別減少39.6%、36.6%，放線菌數(shù)量增加30.5%。從旺長(zhǎng)期到成熟期，根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量分別減少了73.9%、8.0%、18.2%。

團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期，對(duì)照C的細(xì)菌數(shù)量顯著高于處理T；團(tuán)棵期—成熟期，對(duì)照C的放線菌數(shù)量均顯著高于處理T。這可能是處理T石灰氮的殺菌和毒害作用致使土壤中細(xì)菌和放線菌大量死亡所致。移栽前、團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期，處理T與對(duì)照C煙株根際土壤真菌數(shù)量沒(méi)有顯著差異，成熟期則表現(xiàn)為處理T顯著低于對(duì)照C。該煙區(qū)土傳病害以真菌型病害為主[17]，真菌數(shù)量大量減少，一定程度上也減少了真菌病原菌的數(shù)量，從而可能有效降低煙草病蟲(chóng)害的發(fā)生。

表1 施用石灰氮對(duì)煙株根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響Tab.1 Effects of application of lime nitrogen on the number of culturable microorganisms in rhizosphere soil of tobacco plants

注：不同小寫字母表示同種微生物同一處理不同生育時(shí)期差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同種微生物同一時(shí)期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters indicated that the same microorganism had significant difference in different growth stages under the same treatment (P<0.05);Different uppercase letters indicated significant difference between the same microorganism and different treatments at the same stages(P<0.05).

2.2 施用石灰氮對(duì)煙株根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化的影響

2.2.1 Alpha多樣性變化 Alpha多樣性也稱為生境內(nèi)物種多樣性，主要關(guān)注均勻生境下的物種數(shù)目，常利用Alpha多樣性中的OTU值、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Coverage對(duì)煙田根際土壤中微生物多樣性進(jìn)行分析[17-18]。

根據(jù)表2所示，煙草生長(zhǎng)過(guò)程測(cè)定的Coverage≥0.95，表明該數(shù)據(jù)可代表樣本的真實(shí)情況。處理T與對(duì)照C細(xì)菌的OTU值在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中呈先增加后減少，成熟期再次增加的趨勢(shì)，團(tuán)棵期達(dá)到最大值；團(tuán)棵期對(duì)照C的OTU值高于處理T，旺長(zhǎng)期、成熟期表現(xiàn)與團(tuán)棵期相反。處理T真菌OTU值隨著煙株的生長(zhǎng)先增加后減少，團(tuán)棵期達(dá)到最大；對(duì)照C真菌OTU值變化與細(xì)菌OTU值變化類似，團(tuán)棵期和成熟期真菌OTU值均表現(xiàn)處理T低于對(duì)照C，旺長(zhǎng)期則相反。細(xì)菌的Shannon指數(shù)隨著煙株生長(zhǎng)整體表現(xiàn)為先減少后增加再減少的趨勢(shì)；處理T真菌Shannon指數(shù)變化趨勢(shì)與細(xì)菌類似，對(duì)照C真菌Shannon指數(shù)隨著煙株的生長(zhǎng)表現(xiàn)為先減少后增加；處理T細(xì)菌和真菌的Shannon指數(shù)均在旺長(zhǎng)期達(dá)到最大；對(duì)照C的細(xì)菌和真菌Shannon指數(shù)均在移栽前最大。處理T細(xì)菌的Chao1指數(shù)隨煙株生長(zhǎng)逐漸減小，成熟期有所增加；對(duì)照C細(xì)菌的Chao1指數(shù)變化趨勢(shì)與OTU值變化趨勢(shì)一樣。處理T真菌的Chao1指數(shù)隨著煙株的生長(zhǎng)先增加后減少，團(tuán)棵期最高；對(duì)照C真菌的Chao1指數(shù)隨煙株生長(zhǎng)過(guò)程先增加后減少，成熟期再次增加，團(tuán)棵期最高。

表2 施用石灰氮后煙株根際土壤微生物Alpha多樣性變化

2.2.2 群落結(jié)構(gòu)變化 將菌種分布頻率超過(guò)5%的細(xì)菌和真菌認(rèn)定為優(yōu)勢(shì)菌門。由表3可知，在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門有Proteobacteria、Acidobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Bacteroidetes。其中，Bacteroidetes僅在移栽前是優(yōu)勢(shì)菌門，Planctomycetes僅在團(tuán)棵期為優(yōu)勢(shì)菌門，Gemmatimonadetes在旺長(zhǎng)期和成熟期是優(yōu)勢(shì)菌門，其余4個(gè)細(xì)菌門在整個(gè)煙株生長(zhǎng)過(guò)程中均為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。隨著煙株生長(zhǎng)，Proteobacteria和Acidobacteria分布頻率呈先降低后增加趨勢(shì)，Proteobacteria在成熟期分布頻率最高，Acidobacteria在移栽前分布頻率最高；Firmicutes和Actinobacteria分布頻率隨著煙株生長(zhǎng)表現(xiàn)為先增加后降低，F(xiàn)irmicutes在團(tuán)棵期分布頻率最高，Actinobacteria在旺長(zhǎng)期分布頻率最高。Proteobacteria分布頻率在團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期均表現(xiàn)為處理T低于對(duì)照C，成熟期則表現(xiàn)為處理T高于對(duì)照C；Acidobacteria分布頻率在處理T與對(duì)照C之間的變化與Proteobacteria相反。Firmicutes分布頻率在整個(gè)煙株生長(zhǎng)過(guò)程中均表現(xiàn)為處理T低于對(duì)照C；Actinobacteria分布頻率與Firmicutes相反。可見(jiàn)，施用石灰氮對(duì)大多數(shù)細(xì)菌門具有一定的影響，但隨著煙株的生長(zhǎng)這種影響逐漸減弱。

表3 施用石灰氮后煙株根際土壤細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)分布Tab.3 Horizontal community structure of Bacteriaphylum in tobacco rhizosphere after application of lime nitrogen %

注：編號(hào)8、12為尚未確定中文名稱的細(xì)菌門。

Note：Numbers 8 and 12 are the bacteriophytas whose Chinese name haven’t been determined.

由表4可知，在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)真菌門有Ascomycota、Basidiomycota、Zygomycota、Chytridiomycota、Blastocladiomycota。其中Ascomycota和Basidiomycota在煙株整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中都是優(yōu)勢(shì)真菌門，Zygomycota在團(tuán)棵期、旺長(zhǎng)期和成熟期都是優(yōu)勢(shì)真菌門，Chytridiomycota在對(duì)照C成熟期為優(yōu)勢(shì)真菌門，Blastocladiomycota在處理T成熟期是優(yōu)勢(shì)真菌門。在煙株整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，Ascomycota和Basidiomycota分布頻率隨著煙株生長(zhǎng)逐漸降低，但對(duì)照C中Ascomycota的分布頻率在團(tuán)棵期最高，處理T中Basidiomycota的分布頻率在團(tuán)棵期最高。Zygomycota分布頻率隨著煙株生長(zhǎng)逐漸升高，成熟期最高。Ascomycota分布頻率在整個(gè)煙株生長(zhǎng)過(guò)程中都是處理T低于對(duì)照C；Basidiomycota分布頻率在團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期表現(xiàn)為處理T高于對(duì)照C，在成熟期則相反；Zygomycota分布頻率在團(tuán)棵期表現(xiàn)為處理T低于對(duì)照C，旺長(zhǎng)期和成熟期則相反。此外，真菌門水平的分布頻率變幅總體較大，表明煙株生長(zhǎng)對(duì)根際土壤真菌的影響相對(duì)也較大。施用石灰氮處理煙田煙株根際土壤真菌分布頻率變化比對(duì)照C更大，表明施用石灰氮加劇了真菌分布頻率的變動(dòng)，對(duì)真菌類病害發(fā)生會(huì)產(chǎn)生一定影響。另外，由試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，施用石灰氮對(duì)煙株根際土壤真菌的影響大于對(duì)細(xì)菌的影響。

表4 施用石灰氮后煙株根際土壤真菌門水平群落結(jié)構(gòu)分布Tab.4 Horizontal community structure of fungi phylum in tobacco rhizosphere after application of lime nitrogen %

注：編號(hào)7、8為尚未確定中文名稱的真菌門。

Note：Numbers 7 and 8 are the eumycotas whose Chinese name haven’t been determined.

2.2.3 Betta多樣性 PCA主成分分析能夠反映不同調(diào)控措施下煙株根際土壤微生物區(qū)系的變化情況，樣本相似度越高，在圖像中表現(xiàn)越聚集。圖1a為細(xì)菌PCA圖，移栽前與成熟期處理T、對(duì)照C的細(xì)菌群落聚集在一起，說(shuō)明移栽前和成熟期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高；團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期處理T與對(duì)照C的細(xì)菌群落聚集在一起，說(shuō)明團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期的細(xì)菌群落相似度較高。移栽前和成熟期在一個(gè)象限，團(tuán)棵期和旺長(zhǎng)期在另一個(gè)象限，說(shuō)明煙株生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。圖1b是真菌的PCA圖，與圖1a的變化相似，只是各樣本間相對(duì)距離與圖1a相比產(chǎn)生了變化，表明施加石灰氮對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響程度大于對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響程度。

2.3 施用石灰氮對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響

由表5可知，團(tuán)棵期煙株的株高、有效葉數(shù)、莖圍和腰葉大小均表現(xiàn)為處理T高于對(duì)照C，且處理T煙株株高顯著高于對(duì)照C；旺長(zhǎng)期，處理T與對(duì)照C的有效葉數(shù)和莖圍差異不大，但對(duì)照C的株高和腰葉大小明顯大于處理T。

圖1 施用石灰氮后煙田土壤微生物PCA圖Fig.1 PCA map of soil microorganisms in tobacco field after application of lime nitrogen

Tobacco growth stageTreatment/Effective number of leaves/cmPlant height/cmStem girth×/(cm×cm)Waist length×widthT11.00±1.58a21.30±3.03a8.70±0.55a42.00×30.00Rosette stageC10.00±1.00a15.00±6.93b7.63±0.90a36.00×24.33T21.00±2.83a80.00±4.24b9.75±0.35a40.50×23.00Vigorous growth stageC22.67±2.08a96.33±10.97a10.17±0.29a48.00×29.00

注：同列不同小寫字母表示不同生育時(shí)期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between different treatments at the same growth stage (P<0.05).

2.4 施用石灰氮對(duì)煙株病害發(fā)生情況的影響

從表6可以看出，處理T煙株根結(jié)線蟲(chóng)病的發(fā)病率僅為對(duì)照C的1/2，黑脛病的發(fā)病率顯著低于對(duì)照C，說(shuō)明施用石灰氮對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病和黑脛病均具有一定的防控作用。

表6 施用石灰氮對(duì)烤煙病害發(fā)生的影響Tab.6 Effects of lime nitrogen application on the incidence of flue-cured tobacco %

注：同列不同小寫字母表示不同處理差異顯著(P<0.05)。

Note：The incidence of flue-cured tobacco under different treatments was significantly different(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

石灰氮可以有效改良土壤和降低土傳病害發(fā)生率，提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量[18]。但由于土壤微生態(tài)環(huán)境復(fù)雜且處于不斷變化過(guò)程中，石灰氮的分解一般需要8～10 d，為了使石灰氮充分發(fā)揮效應(yīng)，作物的根系又不受損害，一般在種植作物的前25～30 d施用石灰氮[19]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，從移栽前到團(tuán)棵期，施用石灰氮的煙田煙株根際土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量較對(duì)照分別降低了87.0%、89.8%、87.3%，說(shuō)明施用石灰氮可以顯著減少根際土壤微生物的數(shù)量；對(duì)照除了真菌數(shù)量顯著降低82.1%，細(xì)菌和放線菌數(shù)量變化相對(duì)較小，表明隨著煙株生長(zhǎng)，根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量變化不明顯，真菌數(shù)量變化顯著。成熟期，處理T和對(duì)照C的細(xì)菌數(shù)量差異不大，真菌和放線菌數(shù)量均表現(xiàn)對(duì)照C顯著高于處理T?？梢?jiàn)，施用石灰氮對(duì)煙株根際土壤微生物的殺滅作用具有廣泛性，但隨著石灰氮的分解以及煙株的生長(zhǎng)，煙株根際土壤微生物的數(shù)量逐漸恢復(fù)。煙田土壤微生物PCA主成分分析顯示，施用石灰氮可以改變根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，且對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。煙株農(nóng)藝性狀結(jié)果顯示，施用石灰氮后煙株生長(zhǎng)前期(團(tuán)棵期)各指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照C，且株高差異顯著；在煙株生長(zhǎng)中后期(旺長(zhǎng)期)則表現(xiàn)為低于對(duì)照C，株高差異顯著。這可能是由于施用石灰氮后土壤理化性狀如pH值、氮轉(zhuǎn)化等變化對(duì)煙株生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定影響。此外，施用石灰氮可以顯著降低煙草根結(jié)線蟲(chóng)病和黑脛病的發(fā)病率。

由于施用石灰氮對(duì)煙株根際微生物的殺滅作用具有廣泛性，在殺滅病原菌的同時(shí)也會(huì)殺滅益生菌，今后可考慮在施用石灰氮一段時(shí)間后如團(tuán)棵期或旺長(zhǎng)期，在土壤中施加益生菌，但這是否會(huì)影響烤煙的產(chǎn)量和品質(zhì)需要后續(xù)的相關(guān)研究。