聊城市倉(cāng)儲(chǔ)玉米籽粒霉?fàn)€病原菌的分離與鑒定

孫華 郭寧 丁夢(mèng)軍

摘要 為了明確聊城市引起倉(cāng)儲(chǔ)玉米籽粒霉?fàn)€的病原菌種類，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)54份樣本進(jìn)行了病原菌分離和鑒定。結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)病原菌為擬輪枝鐮孢Fusarium verticillioides，其次為哈茨木霉復(fù)合種Trichoderma harzianum species complex，分離頻率分別為31.48%和24.07%，其他病原菌如禾谷鐮孢復(fù)合種F.graminearum species complex、層出鐮孢F.proliferatum、棘孢木霉T.asperellum、黑曲霉Aspergillus niger、黃曲霉A.flavus、草酸青霉Penicillium oxalicum和玉蜀黍絲核菌Rhizoctonia zeae的分離頻率分別為9.26%、1.85%、1.85%、5.56%、5.56%、14.81%和3.70%?；?1個(gè)哈茨木霉復(fù)合種分離物的EF1α基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明該地區(qū)分離到的均為非洲哈茨木霉T.afroharzianum。致病性測(cè)定結(jié)果顯示，非洲哈茨木霉是玉米穗腐病的致病菌且對(duì)玉米產(chǎn)量有一定影響。

關(guān)鍵詞 倉(cāng)儲(chǔ); 籽粒霉?fàn)€; 病原菌; 哈茨木霉

中圖分類號(hào)： S 432.44

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018238

Abstract In order to clarify the pathogens of maize kernel rot during storage in Liaocheng city， the fungi in 54 samples were isolated and identified by a combination of morphological and molecular methods. The results showed that the dominant fungus was Fusarium verticillioides， followed by Trichoderma harzianum species complex （THSC）， which were isolated by 31.48% and 24.07%， respectively. The isolation frequencies of other fungi such as F.graminearum species complex， F.proliferatum， T.asperellum， Aspergillus niger， A.flavus， Penicillium oxalicum and Rhizoctonia zeae were 9.26%， 1.85%， 1.85%， 5.56%， 5.56%， 14.81% and 3.70%， respectively. Phylogenetic analysis based on the EF1α sequences of 11 THSC isolate showed that all isolates in this region were T.afroharzianum. Pathogenicity test revealed that T.afroharzianum was the pathogen of maize ear rot and had some negative effect on corn yield.

Key words storage; kernel rot; pathogens; Trichoderma harzianum

玉米是三大糧食作物之一，在食品和工業(yè)等方面應(yīng)用廣泛。穗腐病菌不僅發(fā)生在玉米生長(zhǎng)后期，也可發(fā)生在貯藏期造成籽粒霉?fàn)€，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量。病原菌產(chǎn)生的毒素等次生代謝產(chǎn)物會(huì)引起人畜中毒，嚴(yán)重者甚至造成死亡[1]。

近年來(lái)，不斷有引起玉米穗腐病病原菌種類的報(bào)道，但大多數(shù)是在玉米生長(zhǎng)后期進(jìn)行樣本采集，且多數(shù)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)病原菌多為擬輪枝鐮孢或禾谷鐮孢復(fù)合種[23]，而關(guān)于在貯藏過(guò)程中引起玉米籽粒霉?fàn)€的病原菌種類的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。溫度和濕度是影響穗腐病發(fā)生的主要因素，玉米灌漿成熟階段遇到連續(xù)陰雨天可加重穗腐病的發(fā)生，玉米在貯存過(guò)程中，當(dāng)貯存溫度高于10℃或籽粒含水量大于14%時(shí)，也可加重籽粒霉?fàn)€[4]。

現(xiàn)有研究表明哈茨木霉復(fù)合種Trichoderma harzianum species complex包括至少14個(gè)種：貴州木霉T.guizhouense、哈茨木霉T.harzianum、非鉤木霉T.inhamatum、T.lentiforme、T.lixii、T.afarasin、非洲哈茨木霉T.afroharzianum、深褐木霉T.atrobrunneum、T.camerunense、T.endophyticum、T.neotropicale、T.pyramidale、T.rifaii和西蒙斯木霉T.simmonsii[5]。本研究在對(duì)采自山東省聊城市農(nóng)戶家中貯藏的籽粒霉?fàn)€的玉米樣本進(jìn)行病原菌分離鑒定的基礎(chǔ)上，采用elongation factor1α（EF1α）基因序列對(duì)分離到的哈茨木霉復(fù)合種進(jìn)行分子鑒定，以明確引起山東省聊城市玉米貯藏過(guò)程中籽粒霉?fàn)€的木霉種類，為玉米在貯藏過(guò)程中的防治籽粒霉?fàn)€提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米籽粒霉?fàn)€樣本：高唐縣11份、東昌府區(qū)11份、冠縣5份、茌平縣10份、陽(yáng)谷縣17份。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。

試劑：2×Es Taq Master Mix，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;真菌基因組DNA提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司;DL2000 DNA Marker，TaKaRa公司;50×TAE，上海生工生物工程有限公司;Biowest Agarose G10，南京生興生物技術(shù)有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

儀器：PCR儀，東勝龍ETC811;GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BioRad公司;DYY11型電泳儀，北京六一儀器廠;Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司;HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 病原菌分離鑒定

取發(fā)病籽粒置于2.0%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，再以無(wú)菌水沖洗3遍，用滅菌濾紙吸干籽粒表面水分后將其放置在PDA平板上，于27℃黑暗條件下培養(yǎng)3～5 d，待長(zhǎng)出菌絲后進(jìn)行分離純化獲得單孢菌株，在新的PDA平板上27℃黑暗培養(yǎng)3～5 d后，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[6]和《中國(guó)真菌志青霉屬及其相關(guān)有性型屬》[7]，根據(jù)菌落形態(tài)和分生孢子的大小及形態(tài)特征等對(duì)菌株進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

將培養(yǎng)好的真菌用真菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，用真菌特異性引物ITS1/ITS4（ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′;ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）[8]和鐮孢菌延伸因子引物EF1/EF2（EF1：5′ATGGGTAAGGARGACAAGAC3′;EF2：5′GGARGTACCAGTSATCATGTT3′）[9]進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1.0 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min;95℃變性1 min，退火溫度下退火30 s（ITS1/ITS4：56℃;EF1/EF2：53℃），72℃延伸45 s，共38個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。所有擴(kuò)增產(chǎn)物均由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3 哈茨木霉復(fù)合種鑒定

將經(jīng)真菌通用引物ITS1/ITS4鑒定為哈茨木霉復(fù)合種的菌株，采用引物EF1728F（5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）[10]和TEF1LLErev（5′AACTTGCAGGCAATGTGG3′）[11]對(duì)其EF1α序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序見(jiàn)1.2，其中退火溫度為53℃。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。所有擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)。以GenBank中哈茨木霉復(fù)合種相關(guān)序列為參考序列，利用MEGA 5.2軟件，采用鄰近法（neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行哈茨木霉復(fù)合種下不同種的鑒定。

1.4 非洲哈茨木霉的致病性測(cè)定

將非洲哈茨木霉分離物在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌水沖洗菌落表面，獲得分生孢子，經(jīng)紗布過(guò)濾后，配制成孢子含量為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，采用花絲通道注射法接種到授粉后3 d的玉米果穗上。收獲前進(jìn)行調(diào)查，記錄發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，54份樣本中分離到的病原菌初步劃分為鐮孢屬Fusarium spp.、木霉屬Trichoderma spp.、青霉屬Penicillium spp.、曲霉屬Aspergillus spp.和絲核菌屬Rhizoctonia spp.;分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)一步表明分離到的病原菌分別為擬輪枝鐮孢F.verticillioides、禾谷鐮孢復(fù)合種F.graminearum species complex、層出鐮孢F.proliferatum、哈茨木霉復(fù)合種T.harzianum species complex、棘孢木霉T.asperellum、黑曲霉A.niger、黃曲霉A.flavus、草酸青霉P.oxalicum、短密青霉P.brevicompactum和玉蜀黍絲核菌R.zeae。其中，除短密青霉外，其他真菌均是玉米穗腐病的已知致病菌。

2.2 真菌的分離頻率

10種真菌中，擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為31.48%;哈茨木霉復(fù)合種次之，為24.07%;然后為草酸青霉，為14.81%。擬輪枝鐮孢和哈茨木霉復(fù)合種在調(diào)查的5個(gè)縣（或區(qū)）均有分布;草酸青霉僅在冠縣未分離到;禾谷鐮孢復(fù)合種僅在東昌府區(qū)、茌平縣和陽(yáng)谷縣分離得到;黑曲霉僅在陽(yáng)谷縣和高唐縣分離得到;黃曲霉僅在高唐縣和東昌府區(qū)分離得到;玉蜀黍絲核菌僅在東昌府區(qū)和陽(yáng)谷縣分離得到;層出鐮孢僅在東昌府區(qū)分離得到，棘孢木霉僅在高唐縣分離得到，短密青霉僅在冠縣分離到（表1）。

高唐縣擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為45.45%，是該縣的優(yōu)勢(shì)病原菌，哈茨木霉復(fù)合種次之，僅為18.18%;東昌府區(qū)哈茨木霉復(fù)合種的分離頻率最高，為27.27%;冠縣擬輪枝鐮孢的分離頻率最高，為60.00%，是該縣的優(yōu)勢(shì)病原菌;在茌平縣，擬輪枝鐮孢、哈茨木霉復(fù)合種、草酸青霉和禾谷鐮孢復(fù)合種的分離頻率相差不大;陽(yáng)谷縣擬輪枝鐮孢和哈茨木霉復(fù)合種的分離頻率相同，均為29.41%，遠(yuǎn)高于其他病原菌的分離頻率（表1）。

1） 各地點(diǎn)后面括號(hào)中的數(shù)字代表該地點(diǎn)的樣本數(shù)。

The numbers in brackets following the region represent the sample numbers at this location.

2.3 哈茨木霉復(fù)合種鑒定

用EF1α基因特異引物擴(kuò)增出一條約為1 300 bp的片段，利用MEGA 5.2軟件，將哈茨木霉復(fù)合種分離物的EF1α基因序列與NCBI上已有的貴州哈茨木霉、哈茨木霉、西蒙斯哈茨木霉、非洲哈茨木霉等采用鄰近法（neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，11個(gè)哈茨木霉復(fù)合種分離物均與非洲哈茨木霉聚在同一分支上，表明其為非洲哈茨木霉Trichoderma afroharzianum（圖1），且在高唐縣、東昌府區(qū)、冠縣、茌平縣和陽(yáng)谷縣均有分布。

2.4 非洲哈茨木霉的致病性測(cè)定

將鑒定為非洲哈茨木霉的病原菌接種玉米果穗后，玉米苞葉過(guò)早干枯，且在苞葉表面覆蓋綠色和白色霉層（圖2a）;果穗發(fā)生腐爛，不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)籽粒較少（圖2b～c）。將發(fā)病組織進(jìn)行病原菌分離純化，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定仍為非洲哈茨木霉。

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外研究表明，玉米穗腐病的致病菌主要為擬輪枝鐮孢及禾谷鐮孢復(fù)合種，在本研究中，引起聊城市倉(cāng)儲(chǔ)玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌為擬輪枝鐮孢，占分離頻率的31.48%，但次優(yōu)勢(shì)病原菌為哈茨木霉復(fù)合種，占分離頻率的24.07%，而禾谷鐮孢復(fù)合種的分離頻率僅為9.26%，這可能與哈茨木霉對(duì)禾谷鐮孢復(fù)合種有較強(qiáng)的抑制作用有關(guān)[12]。

玉米收獲前后易受到各種產(chǎn)毒真菌侵染，生長(zhǎng)階段易感鐮孢菌，儲(chǔ)存階段易染曲霉[4]。在19世紀(jì)70年代美國(guó)就有關(guān)于貯存期引起玉米穗腐病青霉種類的報(bào)道[13]。在本研究中，雖然曲霉和青霉的分離頻率均高于生長(zhǎng)階段采集樣本的分離頻率[14]，但遠(yuǎn)低于擬輪枝鐮孢和哈茨木霉復(fù)合種的分離頻率。這可能是由于哈茨木霉生長(zhǎng)速度快、繁殖能力強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣等特性有關(guān)[15]。

近年來(lái)，關(guān)于哈茨木霉的研究主要集中在對(duì)植物病害的生物防治方面[16]，而關(guān)于哈茨木霉是病原菌的研究較少。姚瑞麗通過(guò)柯赫氏法則證實(shí)哈茨木霉是玉米穗腐病的致病菌[17]。在我國(guó)，關(guān)于哈茨木霉復(fù)合種的研究較少。張廣志等在我國(guó)土壤中分離到哈茨木霉復(fù)合種中的非洲哈茨木霉、深褐木霉和西蒙斯木霉[18]。采用rDNAITS片段進(jìn)行分子鑒定，只能將哈茨木霉鑒定到復(fù)合種水平，因此，多采用EF1α基因序列對(duì)哈茨木霉復(fù)合種進(jìn)行鑒定，本研究將從玉米籽粒樣本上分離到的哈茨木霉復(fù)合種均鑒定為非洲哈茨木霉。按照柯赫氏法則對(duì)非洲哈茨木霉分離物進(jìn)行致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，非洲哈茨木霉能夠引起玉米穗腐病，且能夠侵染玉米的苞葉、籽粒和玉米軸，使玉米苞葉過(guò)早干枯，玉米結(jié)實(shí)率降低，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量，病害癥狀與田間的木霉穗腐病相同。但非洲哈茨木霉是否對(duì)玉米質(zhì)量有影響，有待進(jìn)一步研究。

研究表明，玉米水分活度、環(huán)境溫度是決定儲(chǔ)存玉米籽粒霉變的主要因素。玉米籽粒含水量高或環(huán)境溫度和濕度波動(dòng)大可能導(dǎo)致玉米霉變[4]。因此，明確引起倉(cāng)儲(chǔ)玉米籽粒霉變病原菌的種類，可為進(jìn)一步防治玉米倉(cāng)儲(chǔ)病害提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] MARASAS W F O.Fumonisins： their implications for human and animal health [J]. Natural Toxins，1995，3（4）：193198.

[2] 孫華，郭寧，石潔，等.海南玉米穗腐病病原菌分離鑒定及優(yōu)勢(shì)種的遺傳多樣性分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2017，47（5）：577583.

[3] 孫華，張海劍，馬紅霞，等.春玉米區(qū)穗腐病病原菌組成、分布及禾谷鐮孢復(fù)合種的鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2018，48（1）：815.

[4] 劉增然，張光一，王南南，等.儲(chǔ)存玉米中黃曲霉毒素主要產(chǎn)生菌的檢測(cè)及污染預(yù)防研究[J].植物保護(hù)，2017，43（6）：4652.

[5] CHAVERRI P， BRANCOROCHA F， JAKLITSCH W， et al. Systematics of the Trichoderma harzianum species complex and the reidentification of commercial biocontrol strains [J]. Mycologia，2015，107（3）：558590.

[6] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[7] 孔華忠.中國(guó)真菌志青霉屬及相關(guān)有性型屬[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[8] WHITE T J， BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]∥INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR Protocols： a guide to methods and applications. San Diego： Academic Press， 1990： 315322.

[9] ODONNELL K， WARD T J， ABERRA D， et al. Multilocus genotyping and molecular phylogenetics resolve a novel head blight pathogen within the Fusarium graminearum species complex from Ethiopia [J].Fungal Genetics and Biology，2008，45（11）：15141522.

[10]CARBONE I， KOHN L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes [J]. Mycologia， 1999， 91（3）： 553556.

[11]JAKLITSCH W M， KOMON M， KUBICEK C P， et al. Hypocrea voglmayrii sp. nov. from the Austrian Alps represents a new phylogenetic clade in Hypocrea/Trichoderma [J]. Mycologia， 2005， 97（6）： 13651378.

[12]韓勇軍.哈茨木霉對(duì)禾谷鐮孢病原菌的抑菌活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（2）：356358.

[13]MISLIVEC P B， TUITE J. Species of Penicillium occurring in freshlyharvested and in stored dent corn kernels [J]. Mycologia， 1970， 62（1）： 6774.

[14]秦子惠，任旭，江凱，等.我國(guó)玉米穗腐病致病鐮孢種群及禾谷鐮孢復(fù)合種的鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2014，41（5）：589596.

[15]張衡宇.植病生防菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2011.

[16]陳凱，李紀(jì)順，王貽蓮，等.洞庭湖濕地木霉多樣性及生防活性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（10）：23072320.

[17]姚瑞麗.玉米穗腐病病原鑒定、產(chǎn)毒條件及田間防控研究[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[18]張廣志，張新建，陳泉，等.哈茨木霉復(fù)合種內(nèi)3個(gè)中國(guó)新記錄種的分離和鑒定[J].山東科學(xué)，2015，28（6）：4346.

（責(zé)任編輯：楊明麗）