補(bǔ)腎活血方對宮腔粘連子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)的影響*

劉碧星 賴玉華 羅頌平 陳 鵬 陳忠生

由于各種原因引起子宮內(nèi)膜基底層受損，進(jìn)而導(dǎo)致子宮壁相互粘連的病理現(xiàn)象稱為宮腔粘連。宮腔粘連對育齡期婦女生育能力危害極大，臨床主要表現(xiàn)有月經(jīng)量少或閉經(jīng)，不孕及習(xí)慣性流產(chǎn)。普通人群中宮腔粘連發(fā)生率為1.5%[1]，而不孕癥患者中發(fā)生率高達(dá)13%[2]。宮腔鏡下粘連分離術(shù)已被證實為一種安全有效的治療方法，但仍存在較高的復(fù)發(fā)率。宮腔粘連分離術(shù)后再粘連的預(yù)防是生殖醫(yī)學(xué)界的難題，也是研究的熱點。 有文獻(xiàn)顯示中醫(yī)補(bǔ)腎活血方可減少宮腔粘連術(shù)后復(fù)發(fā)的幾率，但是其原理尚未明確。筆者通過補(bǔ)腎活血方聯(lián)合雌孕激素用于宮腔粘連電切術(shù)后，研究宮腔粘連患者術(shù)前、術(shù)后雌孕激素受體及細(xì)胞增殖蛋白 Ki67的表達(dá)，擬了解補(bǔ)腎活血方的作用機(jī)理，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究選擇婦科住院部符合納入標(biāo)準(zhǔn)的宮腔粘連患者22例，術(shù)前均對其進(jìn)行中國宮腔粘連診斷分級評分，測定增殖期內(nèi)膜厚度，所有患者均行宮腔鏡下粘連電切術(shù)+上環(huán)術(shù)，并在術(shù)中鉗取少許內(nèi)膜組織測定ER、PR、Ki67，術(shù)后給予雌孕激素序貫治療3個月。22例患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組10例及對照組12例。2組年齡、孕產(chǎn)次、人流清宮次數(shù)、術(shù)前增殖期內(nèi)膜厚度、術(shù)前評分等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)有宮腔操作手術(shù)史、月經(jīng)過少或閉經(jīng)，宮腔鏡下診斷為宮腔粘連者[3]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)1)宮腔鏡下診斷為宮腔粘連，擬行宮腔粘連電切術(shù)的患者診斷分級標(biāo)準(zhǔn)參考2015年中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會《宮腔粘連臨床診療專家共識》[3]。2)根據(jù)最新的中國宮腔粘連診斷分級評分≥9分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。3)年齡20～40歲。

表1 宮腔粘連評分標(biāo)準(zhǔn)

注：輕度：總分0～8分；中度：總分9～18分；重度：總分19～28分

1.4 方法

1.4.1 治療方法本研究采用前瞻性試驗性設(shè)計方案，遵循隨機(jī)對照的原則進(jìn)行。對所有納入研究的患者進(jìn)行術(shù)前評分及測定增殖期子宮內(nèi)膜厚度，并行宮腔鏡下粘連電切術(shù)+上環(huán)術(shù)，術(shù)中取少許內(nèi)膜組織測定ER、PR、Ki67的表達(dá),術(shù)后進(jìn)行3個月的藥物治療，藥物治療后在月經(jīng)干凈2～7 d再次行宮腔鏡檢查并取環(huán)，再次評分及測定增殖期內(nèi)膜厚度，并取少許內(nèi)膜組織再次測定其ER、PR、Ki67的表達(dá)水平。治療組10例:給予補(bǔ)腎活血方+雌孕激素序貫治療。補(bǔ)腎活血方在非月經(jīng)期口服，每日2次，連續(xù)3個周期。戊酸雌二醇2 mg每日2次×21 d(月經(jīng)第5天開始服)+地屈孕酮10 mg每日2次×10 d(月經(jīng)第16天開始服)，連續(xù)3個周期。對照組12例：給予雌孕激素序貫治療。戊酸雌二醇2 mg每日2次×21 d(月經(jīng)第5天開始服)+地屈孕酮10 mg每日2次×10 d(月經(jīng)第16天開始服)，連續(xù)3個周期。其中補(bǔ)腎活血方組成：菟絲子20 g，枸杞子15 g，覆盆子15 g，車前子(包煎)10 g，茺蔚子15 g，當(dāng)歸10 g，赤芍10 g，熟地黃10 g，三七10 g，丹參10 g，香附10 g，淫羊藿10 g。戊酸雌二醇片1 mg×1盒,輝瑞制藥; 地屈孕酮片10 mg×1盒,雅培制藥。

1.4.2 觀察指標(biāo)增殖期子宮內(nèi)膜厚度、宮腔粘連評分、ER、PR、Ki67。

1.4.3 標(biāo)本采集及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本采集：手術(shù)時機(jī)選擇在月經(jīng)干凈后2～7 d，閉經(jīng)者手術(shù)時間不受限制。研究員于術(shù)中取適量粘連組織旁的子宮內(nèi)膜組織，對于無明顯子宮內(nèi)膜組織的重度患者取適量粘連組織。取出宮腔組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚3～4 μm，置(60±5)℃的烤箱中烤干(約2 h)。 免疫組織化學(xué)檢測：雌孕激素受體檢測試劑盒(Dako，即用型)，克隆號為EP1及PgR636；兔抗多克隆抗體Ki67 Ab(NovocastraTM，即用型)，克隆號為MIB-1；PBS緩沖液(pH 7.4)、 0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、EDTA抗原修復(fù)液(pH 8.0)、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶以上溶液由中杉金橋公司提供，并按其說明書配制使用。檢測系統(tǒng)：Dako EnVisionTM檢測系統(tǒng)。顯色劑：Dako REALTM DAB顯色劑。對標(biāo)本預(yù)處理后進(jìn)行脫蠟及抗原修復(fù)，按順序取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍(離組織邊緣3 mm左右)畫一圓圈，放回蒸餾水中；相同方法依次對所有組織切片畫圈；移入PBS緩沖液沖洗3 min×3次；按順序取出待測組織切片，甩去玻片上多余的PBS，滴加相應(yīng)抗體，放入孵育盒內(nèi)；抗體的量以充分覆蓋組織塊為度，陰性對照片上滴加PBS緩沖液；切片加完抗體后，蓋上孵育盒蓋子，37℃孵育50 min；滴加PBS緩沖液沖洗，沖洗3 min×3次；將所有組織切片按順序逐一滴加二抗(Dako EnVisionTM檢測系統(tǒng))，抗體的量以充分覆蓋組織塊為度，孵育盒中室溫孵育30 min；滴加PBS緩沖液沖洗，沖洗3 min×3次；顯色、復(fù)染、封片，取20 μl DAB原液和1 ml底物緩沖液混合均勻，一般使用前1 h內(nèi)配制，按順序逐一取出組織切片，甩干組織周圍的多余的PBS，滴加已配好的DAB顯色液顯色2～5 min，同時在顯微鏡下觀察，根據(jù)染色強(qiáng)弱及背景顏色適時終止顯色。判斷標(biāo)準(zhǔn)：研究者在顯微鏡(400×)下觀察切片，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判定，在每個切片中選擇5個高倍鏡視野。 ER、PR結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：強(qiáng)陽性(+++，棕黃色細(xì)胞≥60%或深褐色細(xì)≥30%)，中度陽性(++，淺黃色細(xì)胞≥50%或20%≤棕黃色細(xì)胞，弱陽性(+，淺黃色細(xì)胞<50%或棕黃色細(xì)胞<20%)，陰性(-，無染色)。 Ki67結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)： 陽性細(xì)胞數(shù)0～5%為(-)，6%～25%為(+)， 26%～50%為(++)，≥51%為(+++)。強(qiáng)陽性為4分，中度陽性為3分，弱陽性為2分，陰性為1分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法全部數(shù)據(jù)采用χ2檢驗、t檢驗或Fishers Exact Test Pearson 相關(guān)分析檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分析采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 2照患者組年齡、孕產(chǎn)次、人流清宮次數(shù)2組間年齡、孕次、產(chǎn)次和人流清宮次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者臨床資料比較 (例，

2.2 2組患者治療前后ER、PR、ki67表達(dá)評分比較2組間ER、PR、K-67表達(dá)治療前差異不顯著(P>0.05)，治療后兩組上述各指標(biāo)均較治療前顯著上升(P<0.05)。除Ki67外，治療后治療組ER、PR評分均顯著高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 2組患者治療前后內(nèi)膜厚度、評分比較2組治療后內(nèi)膜厚度均較治療前顯著上升(P<0.05)，評分顯著下降(P<0.05)，且治療組上述情況顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)。見表4。

表3 2組患者治療前后ER、PR、Ki67表達(dá)評分比較 (例，

注：與治療前比較(治療組：tER=2.741，P=0.013；tPR=2.685，P=0.015；tKi67=2.173，P=0.043；對照組：tER=2.137，P=0.044；tPR=3.130，P=0.005；tKi67=3.298，P=0.003),1)P<0.05；與對照組比較(tER=2.596，P=0.017；tPR=2.099，P=0.049)，2)P<0.05

表4 2組患者治療前后內(nèi)膜厚度、評分比較 (例，

注：與治療前比較(治療組：t內(nèi)膜厚度=3.327，P=0.004；t評分=6.870，P=0.000；對照組：t內(nèi)膜厚度=3.426，P=0.002；t評分=7.179，P=0.000)，1)P<0.05；與對照組比較(t內(nèi)膜厚度=2.265，P=0.035；t評分=2.171，P=0.042)，2)P<0.05

3 討論

宮腔粘連嚴(yán)重危害女性的生育力，并且治療后存在較高的復(fù)發(fā)率，其中重度粘連術(shù)后復(fù)發(fā)率可高達(dá)62.5%[4]。預(yù)防宮腔粘連術(shù)后復(fù)發(fā)目前是醫(yī)學(xué)難題，其中治療方法也在不斷推陳出新，而各家有各家的治法和經(jīng)驗?？傮w上來說目前治療方法有以下3個方面：1)通過放置宮內(nèi)節(jié)育器、宮腔球囊、防粘劑及防粘連膜等直接阻礙子宮內(nèi)膜前后壁創(chuàng)面的接觸；2)通過用雌孕激素周期模仿正常人的激素改變來刺激殘余的子宮內(nèi)膜生長并使術(shù)后創(chuàng)面重新上皮化；3)通過羊膜移植、子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植等方法，然而這些方法尚在研究階段，沒有在臨床上廣泛應(yīng)用。通過物理屏障防止宮腔粘連只是權(quán)宜之計，當(dāng)物理屏障去除，粘連可能再次發(fā)生。而在臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)大劑量的雌激素也并不能達(dá)到理想的效果，經(jīng)過激素治療患者的月經(jīng)量并沒有增加，內(nèi)膜沒有增厚，生育問題依舊無法解決。 筆者假設(shè)大劑量雌孕激素?zé)o法起效的原因可能是宮腔粘連內(nèi)膜損傷后導(dǎo)致雌孕激素受體表達(dá)下降，雌孕激素?zé)o法與足夠的受體結(jié)合，進(jìn)而無法達(dá)到相應(yīng)的生物效應(yīng)。

張娟等[5]應(yīng)用免疫組化SP法檢測30例子宮內(nèi)膜各層中ER、PR的表達(dá)，結(jié)果提示功能層、基底層和淺肌層中ER和PR蛋白表達(dá)水平是依次降低的，由此可能提示子宮內(nèi)膜不同損傷部位的 ER和 PR表達(dá)并不一致。杜艷芳等[6]檢測宮腔粘連組(實驗組)和非宮腔粘連組(對照組)子宮內(nèi)膜組織中ER、PR和NF-кB的表達(dá)水平，結(jié)果顯示非宮腔粘連組子宮內(nèi)膜中 ER和PR的表達(dá)均高于宮腔粘連組，在輕度粘連組的表達(dá)高于重度粘連組(P<0.05)。ER在輕度粘連組中的表達(dá)也高于中度粘連組(P<0.05)。由于ER和 PR主要在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)，一旦破壞了子宮內(nèi)膜基底層，殘留的子宮內(nèi)膜減少，ER和 PR的表達(dá)就相應(yīng)降低，而雌孕激素對靶細(xì)胞的效應(yīng)強(qiáng)弱與靶細(xì)胞中雌孕激素受體水平高低密切相關(guān)， ER和 PR的表達(dá)下降直接影響子宮內(nèi)膜在雌孕激素作用下的增生和修復(fù)，從而影響宮腔粘連的治療效果。而Ki67是一種細(xì)胞增殖性抗原，維持細(xì)胞循環(huán)的新蛋白，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的一個重要標(biāo)志[7]。目前關(guān)于Ki67的研究主要集中在腫瘤學(xué)方面。宮腔粘連患者內(nèi)膜功能層受損，內(nèi)膜菲薄，是否與細(xì)胞增殖障礙有關(guān)呢？ 因此筆者在研究中將Ki67的表達(dá)加入本次研究的范疇。

本研究結(jié)果顯示治療前2組間ER、PR、Ki67表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，治療后2組上述各指標(biāo)均較治療前顯著上升(P<0.05)。除Ki67外，治療后治療組ER、PR評分均顯著高于對照組(P<0.05)。2組治療后內(nèi)膜厚度均較治療前顯著上升(P<0.05)，評分顯著下降(P<0.05)，且治療組上述情況顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)。研究結(jié)果顯示補(bǔ)腎活血方及雌孕激素能均能提高雌孕激素受體及細(xì)胞增殖蛋白Ki67的表達(dá)，且加用補(bǔ)腎活血方比單用雌孕激素對提高雌孕激素受體的表達(dá)、增加術(shù)后增殖期內(nèi)膜厚度及降低宮腔粘連評分的效果更優(yōu)，而2組治療后細(xì)胞增殖蛋白Ki67的表達(dá)沒有明顯差異。

中醫(yī)古籍中并無“宮腔粘連”的記載，然宮腔粘連病位在胞宮，多是手術(shù)時胞宮、胞脈受損，腎精受損，沖任氣血不足,精血俱損，瘀血邪毒內(nèi)蘊(yùn)，胞脈閉塞所致，結(jié)合其月經(jīng)過少、閉經(jīng)的臨床表現(xiàn)，究其病因病機(jī),多責(zé)之于腎虛血瘀?！蹲C治準(zhǔn)繩·女科·調(diào)經(jīng)門》指出：“經(jīng)水澀少,為虛為澀,虛則補(bǔ)之,澀則濡之?！惫恃a(bǔ)腎活血為本病的治療大法。本病病機(jī)虛實錯雜，既不可妄行攻破，以免重傷精血，又不可一味填補(bǔ)，使瘀血不去，新血難生。本研究中補(bǔ)腎活血方由菟絲子、枸杞子、覆盆子、車前子、茺蔚子、當(dāng)歸、赤芍、熟地黃、三七、丹參、香附、淫羊藿組成，該方以菟絲子和枸杞子為君藥，補(bǔ)肝腎之陰，覆盆子、熟地黃滋精生血為臣藥，淫羊藿溫補(bǔ)腎陽，助陰長，車前子微寒輕瀉腎中虛火為佐藥，茺蔚子入血分，善活血行氣，祛瘀通徑，香附行氣解郁，疏肝通經(jīng)，當(dāng)歸、赤芍、三七、丹參活血化瘀，助氣血運(yùn)行，全方補(bǔ)中有通，攻補(bǔ)兼施，使精氣盛，沖任充，瘀血去，新血生，血海自能滿溢。學(xué)者們對補(bǔ)腎活血中藥的機(jī)理也從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度進(jìn)行了相關(guān)的研究。陳媛媛等[8]的研究認(rèn)為補(bǔ)腎中藥具有類雌激素樣作用，能調(diào)整腎-天癸-沖任-胞宮軸，改善盆腔內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)的增殖與修復(fù)，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜雌孕激素受體的表達(dá)，以達(dá)到治療宮腔粘連的目的。賈金英等[9]認(rèn)為活血化瘀藥物可以促進(jìn)微循環(huán)功能,改善宮腔內(nèi)組織缺血狀態(tài),促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬功能；能將纖維蛋白清除使間質(zhì)細(xì)胞再生修復(fù),從而促進(jìn)局部瘀血的吸收，結(jié)締組織松解而達(dá)到生理性恢復(fù)粘連的目的。

綜上所述，補(bǔ)腎活血方聯(lián)合雌孕激素可有效預(yù)防宮腔粘連電切術(shù)后再粘連的發(fā)生，改善宮腔環(huán)境，增加內(nèi)膜厚度，其作用機(jī)制可能通過提高雌孕激素受體的表達(dá)來完成。但該研究樣本量較少，需要更多的樣本支持及動物實驗研究來進(jìn)一步證明。