基于高通量測序技術(shù)測定普通棉耳狨猴糞便微生物多樣性

張飛燕，金潔，劉超，王蕓，謝麗分，張曉迪，鄔繼文，呂龍寶,2*

(1. 中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明 650000； 2. 中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心，昆明 650223)

微生物區(qū)系的生長受到胃腸道功能的影響，胃腸道的定植以共生的方式進(jìn)化，微生物群對宿主有多種有益的作用[1]。微生物菌群通過抑制致病性腸內(nèi)生物(如志賀菌、沙門菌)的定殖來保護(hù)宿主不受感染[2]。另外，微生物群對宿主的生理、能量代謝等也起重要作用。因此，普通綿耳狨猴腸道菌群的完整性與穩(wěn)定性與健康息息相關(guān)。早期的培養(yǎng)技術(shù)，使用多種培養(yǎng)基和多個條件培養(yǎng)微生物，僅能檢測到腸道微生物的一小部分，這部分細(xì)菌僅占胃腸道微生物的1%左右[3]。分子鑒定方法仍然存在分辨率較低、重復(fù)性差、操作繁瑣等缺點(diǎn)，如DGGE技術(shù)，只能對 200～700 bp 的片段有效地分離，過大或者過小的片段分離效果都不是很好等問題[4]，僅能檢測到占總量 1%以上的微生物?；诟咄繙y序能全面檢測樣品，數(shù)據(jù)量大、測序快速等優(yōu)點(diǎn)，已被普遍用于細(xì)菌多樣性分析[5]。

普通綿耳狨猴是一種體型小的新大陸猴，雌雄的身高相仿，雄性平均高188 mm，雌性平均高184 mm，雄性體重比雌性稍重，成年雌性體重在230～340 g，成年雄性體重在250～450 g，毛色由棕、灰、黃三色組成，耳朵周圍由白色的毛形成簇，尾巴帶有條紋，面部皮膚較暗，暴露于燈光下顏色較深，前額皮膚呈白色。普通綿耳狨猴體型比恒河猴小，更容易安置；每年生育2次，繁殖率高、方便實(shí)驗(yàn)操作且不易攜帶猴 B病毒等優(yōu)勢，此外，狨猴比體型較大的猴成熟和衰老的速度更快，更有利于發(fā)育和衰老疾病的研究[6-7]。近年來，美國等國家興起了狨猴熱，呼吁加強(qiáng)狨猴科學(xué)研究。狨猴作為諸多學(xué)科研究用的非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也在擬定，然而，目前有關(guān)普通綿耳狨猴腸道細(xì)菌的報(bào)道較少。這些研究主要采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，以及以克隆/測序?yàn)橹饕侄蔚姆肿由飳W(xué)技術(shù)。缺乏有關(guān)普通綿耳狨猴腸道細(xì)菌的高通量測序研究。因此，普通棉耳狨猴在其實(shí)驗(yàn)動物化培育過程中，微生物檢測及其相關(guān)研究很重要。本試驗(yàn)旨在應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究本單位引進(jìn)的實(shí)驗(yàn)用普通棉耳狨猴細(xì)菌結(jié)構(gòu)與組成，為進(jìn)一步開發(fā)利用這一新型實(shí)驗(yàn)動物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性棉耳狨猴4只，來源于重慶第三軍醫(yī)大動物中心，體重370～420 g，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在中國科學(xué)院昆明靈長類研究中心進(jìn)行【SCXK(滇)K2017-003】和【SYXK(滇)K2017-0008】，恒溫恒濕環(huán)境，室溫控制在26～28℃，相對濕度在35%～60%，每天自然光照時間為7：30-18：30，期間配合日光燈照射。每日飼喂配合飼料，輔以清潔水果，自由飲水。

1.1.2 樣本采集

準(zhǔn)備好糞便容器收集糞樣，戴無菌手套采取新鮮糞便中段內(nèi)部5 g左右，編號C1、C2、C3、C4，迅速放到液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱待檢。所有糞樣采集時爭取在排泄后 10 min 內(nèi)完成。

1.1.3 主要試劑和儀器

Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，高效高保真酶(New England Biolabs 公司)，GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific 公司)，IonS5TMXL測序平臺。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌總DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用 CTAB 方法對4個樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，針對16S RNA的V3-V4區(qū)(338F-806R)，使用帶 Barcode 的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。使用Thermo GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific 公司)回收。

1.2.2 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)優(yōu)化分析，樣品復(fù)雜度分析，計(jì)算Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Sobs指數(shù)和覆蓋指數(shù)(Coverage)等多樣性指數(shù)，繪制樣品稀釋曲線， 對OTUs代表序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋及糞便有益菌群分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 測序水平

本研究利用Illumina MiSeq測序平臺對4個普通棉耳狨猴糞便樣本的V3-V4區(qū)進(jìn)行測序研究，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾嵌合體后優(yōu)化分析，共得到31 5511條有效序列，平均每個樣本獲得78 878條序列；通過對測序數(shù)據(jù)按97%的相似水平進(jìn)行聚類分析，共獲得596個OTU，平均每個樣本 149個。

2.2 樣品的復(fù)雜度分析

對4個樣品在97%一致性閾值下的α多樣性指數(shù)(Alpha Diversity)分析指數(shù)(Shannon、Simpson、chao1、ACE、Good’s coverage)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，普通棉耳狨猴糞便細(xì)菌的Shannon 指數(shù)是3.786， Chao指數(shù)是160， Simpson指數(shù)為0.88，通過Shannon稀釋曲線分析(圖1)，4個樣本的曲線都趨近平緩，并且覆蓋度Good’s coverage達(dá)到99.99%，兩者共同說明了對所取樣本微生物群落的檢測比率接近飽和，目前的測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

選用 Weighted Unifrac 距離和 Unweighted Unifrac 距離兩個指標(biāo)來衡量兩個樣品間的相異系數(shù)，其值越小，表示這兩個樣品在物種多樣性方面存在的差異越小。以 Weighted Unifrac 和 Unweighted Unifrac 距離繪制的Heatmap展示結(jié)果(圖2)，圖中樣品C4與C1的加權(quán)及非加權(quán)距離分別為0.211和0.310， C3與C1的加權(quán)及非加權(quán)距離分別為0.693和0.348，樣品C2與C1的加權(quán)及非加權(quán)距離分別為0.159和0.342，說明C2與C1樣品的物種組成相似，C4與C1的物種多樣性差異比C3與C1之間的物種多樣性差異小。

圖2 Beta多樣性指數(shù)熱圖Figure 2 Beta diversity index heatmap

2.3 物種注釋

本研究普通棉耳狨猴糞便細(xì)菌鑒定出有9個門、14個綱、26個目、50個科、82個屬和64個種和226個OTU.

2.3.1 在門水平上的菌群組成

在門水平上，物種組成分析共獲得9 個門，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌門， 其次門水平含量大于1%的有放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)。 其他3個門為柔膜菌門(Tenericutes)、Spirochaetes、Melainabacteria僅占到0.008%。 柔膜菌門(Tenericutes)和Melainabacteria僅在C4樣品中存在(圖3)。

2.3.2 在綱水平上的菌群組成

在綱水平上，共獲得14個綱，擬桿菌綱(Bacteroidia)和厭氧菌綱(Negativicutes)為優(yōu)勢菌綱。其次豐度大于1%的綱有放線菌綱(Actinobacteria)，芽孢桿菌綱(Bacilli)，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)，梭菌綱(Clostridia)， 梭桿菌綱(Fusobacteriia)。豐度排在前十的綱還有丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、Coriobacteriia綱。其中γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)三大綱均勻的分布在C3樣品中(圖4)。

圖3 門水平上的菌群組成Figure 3 Community analysis pieplot on phylum level

圖4 綱水平上的菌群組成Figure 4 Community analysis pieplot on class level

2.3.3 在目水平上的菌群組成

在目水平上，共獲得26目，擬桿菌目(Bacteroidales)和Selenomonadales目，豐度大于1%的目有雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)，乳桿菌目(Lactobacillales)，巴斯德菌目(Pasteurellales)，腸桿菌目(Enterobacteriales)，梭菌目(Clostridiales)，梭桿菌目(Fusobacteriales)。 豐度排在前十的目還有芽孢桿菌目(Bacillales)、Coriobacteriales。(見圖5)

2.3.4 在科水平上的菌群組成

在科水平上，共獲得50個科，普雷沃菌科(Prevotellaceae)和雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)所占豐度最高，其次豐度大于1%的擬桿菌科(Bacteroidaceae)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)，韋榮球菌科(Veillonellaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，梭桿菌科(Fusobacteriaceae)，鏈球菌科(Streptococcaceae)。(見圖6)

圖5 目水平上的菌群組成Figure 5 Community analysis pieplot on order level

圖6 科水平上的菌群組成Figure 6 Community analysis pieplot on family level

2.3.5 在屬水平的菌群組成

在屬水平上，共獲得82屬，豐度前10 的屬，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)，擬桿菌屬(Bacteroides)，魏斯菌屬(Weissella)，未鑒定的普雷沃菌科(unidentified_Prevotellaceae)，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)，Aggregatibacter屬，鏈球菌屬(Streptococcus)， 擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)，帕拉普菌屬(Paraprevotella)， 梭菌屬(Fusobacterium)。通過結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)有益細(xì)菌雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的豐度相對較高，平均含量：11.33%，在所檢測樣本中都含有。另外，通過多序列比對得到top100屬的代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，擬桿菌屬(Bacteroides)這個屬，屬于Bacteroidetes門，在四個分組中都存在，在C1樣本內(nèi)豐度高于C2樣本，在C3組內(nèi)豐度最小。變形菌門中的Aggregatibacter屬，厚壁菌門中的 明串珠菌屬(Leuconostoc)，魏斯菌屬(Weissella)，梭桿菌門中的梭菌屬(Fusobacterium)僅在C3樣品中存在。放線桿菌中的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)在四個樣品中都存在，在C3樣品內(nèi)豐度高于C2樣本，在C1樣本豐度最小。 (見圖7)

2.3.6 在種水平的菌群組成

豐度最高的前10個種，歸類為7個科、5個綱(表1)。即擬桿菌科、普雷沃菌科、雙歧桿菌科、梭桿菌科、明串珠菌科、鏈球菌科、巴斯德菌科。這10個種，隸屬于擬桿菌綱、放線菌綱、梭桿菌綱、芽孢菌綱、γ-變形菌綱5個綱。這10個種占到33.16%，其他53種總和僅占到0.74%，其他未鑒定出的大部分菌種，相對豐度還較高，需要進(jìn)一步的研究。

圖7 屬水平上的菌群組成Figure 7 Community analysis pieplot on genus level

綱科種豐度(%)ClassesFamiliesSpeciesAbundance(%)普通擬桿菌Bacteroides_vulgatus8.35卵形擬桿菌擬桿菌綱擬桿菌科BacteroidaceaeBacteroides ovatus2.31Bacteroidia單形擬桿菌Bacteroides_uniformis0.11普雷沃菌科人體普菌PrevotellaceaePrevotella_copri8.11放線菌綱雙歧桿菌科雙歧桿菌屬ActinobacteriaBifidobacteriaceaeBifidobacterium_sp_MRM_5224.38梭桿菌綱梭桿菌科FusobacteriiaFusobacteriaceaeFusobacterium_canifelinum1.00明串珠菌科Leuconostocaceae食竇魏斯菌Weissella_cibaria4.52芽孢菌綱Bacilli鏈球菌科Streptococcaceae血鏈球菌Streptococcus_sanguinis7.57中間鏈球菌 Streptococcus_intermedius1.80γ-變形菌綱Gammaproteobacteria巴斯德菌科Pasteurellaceae嗜沫凝聚桿菌Aggregatibacter_aphrophilus3.48

2.3.7 PICRUS功能預(yù)測

根據(jù)所有樣品在KEGG數(shù)據(jù)庫中的功能預(yù)測及豐度信息，選取豐度排名前 35 的功能及它們在每個樣品中的豐度信息繪制熱圖，并從功能差異層面進(jìn)行聚類。以基于ko的豐度聚類熱圖為例展示如下(圖8)：通過功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、能量代謝等代謝功能很豐富，以及蛋白修飾、折疊、翻譯等遺傳功能豐富，結(jié)果表明狨猴體內(nèi)的微生物代謝和遺傳信息處理功能很豐富。

圖8 功能豐度聚類分析圖Figure 8 Functional cluster heatmap

3 討論

目前，有關(guān)普通棉耳狨猴腸道菌群的研究報(bào)道甚少?；旧隙际腔趥鹘y(tǒng)分離培養(yǎng)和分子鑒定法。有研究表明，采用宏基因組學(xué)測序能檢測到>106每克糞便的細(xì)菌，PCR>104每克糞便的細(xì)菌，培養(yǎng)組學(xué)>102每克糞便的細(xì)菌[8-10]。高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和分子鑒定方法相比具有檢測閾值更低，能全面檢測樣品，數(shù)據(jù)量大、測序快速等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序技術(shù)，研究普通棉耳狨猴糞便微生物在不同分類水平上的組成及有益菌群分析。本試驗(yàn)采用的是基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)的IonS5TMXL測序平臺，通過半導(dǎo)體芯片直接將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，不需要激光、照相機(jī)或標(biāo)記，相比HiSeq2500讀長更長，更簡單、更快速、更靈活，為微生物多樣性研究提供更多的選擇[11]。本試驗(yàn)的shannon 稀釋曲線趨近平緩及本試驗(yàn)的覆蓋度(Good’s coverage)達(dá)到99.99%，說明了對所取樣本微生物群落的檢測比率接近飽和。目前的測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。根據(jù)距離繪制的Heatmap圖分析表明4個樣本間的菌群組成有差異。4只健康普通棉耳狨猴糞便微生物的種類和數(shù)量不完全相同可能由個體身體狀況、飲食量等試驗(yàn)樣品本身差異造成。本研究共鑒定出普通棉耳狨猴糞便菌群的有9個門、14個綱、26個目、50個科、82個屬和64個種和226個OTU。

通過OTU聚類分析和物種組成分析，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌門，平均含量54.52% 和25.39%。伊麗娜等[12]文獻(xiàn)綜述報(bào)道其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為非人靈長類腸道菌群的優(yōu)勢菌門，與本次研究結(jié)果一致。另外，朱乃軍等[13]通過對40只普通棉耳型狨猴糞便菌群進(jìn)行研究分析，通過培養(yǎng)法篩選出變形菌門的大腸桿菌、厚壁菌門的糞腸球菌在所有樣本中的分離率高達(dá)90以上，與我們所檢測到的主要菌門一樣，但在種屬層面上差異很大。在屬的水平上，析發(fā)現(xiàn)有益細(xì)菌雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的豐度相對較高，平均含量11.33%，在4個樣本中都含有?？茖W(xué)研究表明雙歧桿菌是存在于人和動物體內(nèi)重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)氨基酸代謝，改善脂質(zhì)代謝等對宿主的營養(yǎng)作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫，降解體內(nèi)有毒物質(zhì)抑制腫瘤生長等生理功能[14-15]。總之，雙歧桿菌在動物疾病預(yù)防、營養(yǎng)等方面具有重要的作用。近年來，雙歧桿菌制劑已被廣泛的應(yīng)用到豬、雞、兔等養(yǎng)殖方面，并證實(shí)在提高動物生長性能方面具有良好的作用[16]。目前，雙歧桿菌制劑在非人靈長類(普通棉耳狨猴)上還沒應(yīng)用，這也是將來開發(fā)的一個方向。

本研究采用16S RNA測序技術(shù)在種水平上僅能鑒定出一部分，其中擬桿菌所占的比例最大。擬桿菌在人類消化道中占主要部分，健康狀態(tài)下，擬桿菌是腸道菌群的重要組成部分，與其他菌共同行使腸道菌群的正常功能[17]。還有一大部分相對豐度較高的菌種需要進(jìn)一步研究。由于本研究選擇的16S rRNA測序一般研究深度到屬水平，全基因組測序研究到種水平。因此，未來綜合利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組或代謝組多種組學(xué)技術(shù)對生物樣本進(jìn)行系統(tǒng)研究，可進(jìn)一步探究微生物的群體功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)掘潛在的生物學(xué)意義，為進(jìn)一步了解普通棉耳狨猴這種新型實(shí)驗(yàn)動物奠定基礎(chǔ)。