低氟鋁長期與高氟鋁短期暴露后大鼠骨生長的比較研究

黃連芳，陳艷

(廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

氟(fluorine，F(xiàn))是人體重要的微量元素之一，在正常的生理代謝過程中，適量的氟有利于鈣和磷的利用，增加骨骼的硬度。當(dāng)氟超過生理需要量時(shí)，將導(dǎo)致急性或慢性氟中毒。慢性氟中毒以骨骼損害為主要表現(xiàn)，以地區(qū)性發(fā)病為特點(diǎn)，簡稱氟骨癥。目前我國仍然是氟中毒流行較嚴(yán)重的國家之一，其中貴州省流行最廣，病情最重。由于其特殊的地域特點(diǎn)和飲食習(xí)慣，同時(shí)還伴隨著鋁(aluminum，Al)元素的過度吸收和蓄積，出現(xiàn)特殊的氟鋁聯(lián)合中毒，至今嚴(yán)重骨骼畸形及致殘的病例仍然可見[1]，另外，習(xí)慣飲用磚茶的內(nèi)蒙古及東北地區(qū)的人群，由于磚茶中氟、鋁的含量都高于正常，也存在著氟鋁聯(lián)合中毒的危險(xiǎn)因素[2]。因此氟鋁聯(lián)合中毒的深入研究對于生存在高危因素環(huán)境下的地區(qū)人群仍然具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

氟骨癥的骨相損害包括骨硬化、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨周軟組織骨化以及關(guān)節(jié)的退行性改變。鋁中毒時(shí)的骨相損害主要表現(xiàn)為骨軟化，包括軟骨內(nèi)成骨障礙和骨礦化障礙[3]。氟鋁聯(lián)合攝入時(shí)，在胃腸道中容易形成氟化鋁復(fù)合物，影響兩者的吸收，最終的效應(yīng)并非單純的累積疊加。通過對不同比例的氟鋁聯(lián)合攝入實(shí)驗(yàn)的血液和骨中的元素分析結(jié)果表明，低中劑量的鋁與氟同時(shí)攝入，兩者有互相的拮抗吸收作用，高劑量的鋁，由于其直接對腸道吸收部位的毒性作用，反而使鋁氟的吸收不再增加。而氟是鋁的促進(jìn)劑，促其在組織中蓄積并增強(qiáng)其毒性。在高氟的環(huán)境中，即使食物或飲用水的鋁含量很低，鋁仍能在骨組織中顯著蓄積，表現(xiàn)出兩者的協(xié)同作用。氟鋁在骨中聚集的結(jié)果就是導(dǎo)致以氟中毒或鋁中毒為主的，或兩者協(xié)同作用下的骨骼損害。氟鋁聯(lián)合中毒對關(guān)節(jié)和軟骨也有影響，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氟對軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)，高劑量抑制其增生，促進(jìn)細(xì)胞分化凋亡的作用，并且鋁單獨(dú)作用的毒性甚至要大于氟和氟鋁聯(lián)合對軟骨細(xì)胞的影響[4]。目前關(guān)于氟鋁聯(lián)合中毒對骨骼損害的研究，多數(shù)集中探討與氟鋁劑量的關(guān)系，并且很多是基于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對于不同劑量氟鋁暴露時(shí)間不同對骨重建狀態(tài)及長骨生長發(fā)育的影響的比較研究還少見報(bào)道。因此，本研究為了闡明高劑量氟鋁短期暴露與低劑量氟鋁長期暴露時(shí)是否有相同的軟骨生長和骨重建特點(diǎn)，通過骨組織病理學(xué)、形態(tài)計(jì)量學(xué)方法觀察及測量大鼠長骨骺端生長板結(jié)構(gòu)及次級小梁骨的骨代謝參數(shù)并進(jìn)行比較，為地方性鋁氟聯(lián)合中毒的深入研究和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級SD大鼠48只，雌雄各半，體重170～190 g，8周齡，均購于廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2008-0008】，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(粵)2008-0007】。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度22～26℃，濕度(60 ± 10)%，正常明暗交替，實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求。

1.1.2 主要試劑與儀器

不脫鈣制片所需慢速鋸(Buehler，美國)，硬組織切片機(jī)(RM2265，Leica，德國)；骨形態(tài)計(jì)量分析所需熒光顯微鏡(DMLB，Leica，德國)及顯微照相機(jī)(Olympus DP72，日本)，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)測量系統(tǒng)(OsteoMetrics，Inc，美國)。

氟化鈉(NaF CAS: 7681-49-4 批號：20130528天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，氯化鋁(AlCl3CAS:7446-70-0批號：20121102天津市福晨化學(xué)試劑廠)，染色劑甲苯胺藍(lán)(CAS: 92-31-9 批號：71041284，Sigma Chemical Co.美國)；包埋單體采用甲基丙烯酸甲酯(CAS: 1330-20-7 批號：20161017，北京化工廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及氟鋁中毒模型構(gòu)建

大鼠一周適應(yīng)性飼養(yǎng)，無異常發(fā)現(xiàn)后，根據(jù)體重由小到大排序，編號，48只8周齡清潔級SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組8只：正常對照45 d和90 d組；低劑量氟加鋁[5 mg/(kg·d) NaF + 0.1 mg/(kg·d) AlCl3，Low F + Al, LF + Al]，分別45 d和90 d組；高劑量氟加鋁[15 mg/(kg·d) NaF + 0.1 mg/(kg·d) AlCl3，High F + Al，HF + Al]，分成45 d及90 d組。氟和鋁的劑量是目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用到的最小劑量[5]。

對照組生理鹽水按10 mL/kg用量灌胃，藥物組將氟化鈉及氯化鋁配置成溶液后灌胃，每日1次，分別給藥45 d和90 d。實(shí)驗(yàn)期間根據(jù)每周稱重調(diào)整給藥劑量。分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，全麻下心臟采血處死大鼠并立即取材。

1.2.2 骨形態(tài)學(xué)標(biāo)本制備及形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測量

分離雙側(cè)脛骨，取一側(cè)除凈肌肉和軟組織等附屬結(jié)構(gòu)，矢狀面鋸掉脛骨粗隆部分，暴露骨髓腔，橫斷后取脛骨近端約1 cm的骨樣本固定液中存放，之后經(jīng)過逐級脫水，脫脂，甲基丙烯酸甲酯包埋，打磨光滑后再經(jīng)硬組織切片機(jī)切成10 μm和5 μm的切片。厚片直接封片在熒光顯微鏡下進(jìn)行骨代謝及小梁微結(jié)構(gòu)的測量分析。薄片甲苯胺藍(lán)法染色，光鏡下觀察骺板(生長板)軟骨細(xì)胞層，初級骨小梁以及初級小梁往下延伸3 mm區(qū)域內(nèi)次級小梁的相關(guān)計(jì)量學(xué)分析。其測量范圍及參數(shù)含義參見相關(guān)文獻(xiàn)[6]。

主要微結(jié)構(gòu)參數(shù)有骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume，BV/TV)，骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)，骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)，生長板厚度(growth plate width，G.P.Wi)。反映骨代謝的參數(shù)有骨形成和吸收參數(shù)，骨周長(bone surface，BS)，骨小梁熒光周長(mineralized surface，MS)，礦化沉積率(mineral apposition rate，MAR)，骨形成率(bone formation rate，BFR)，成骨細(xì)胞周長(osteoblast surface，Ob.S)，及類骨質(zhì)周長(osteoid surface，OS)等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同氟鋁劑量和暴露時(shí)間對大鼠體重的影響

短期內(nèi)(45 d)不管氟鋁劑量高低，大鼠體重都是增加的，與正常組比較差異無顯著性。45 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(90 d)，體重(包括正常組的)進(jìn)入緩慢增長期，低劑量組的體重變化與正常組一致，而高劑量組90 d時(shí)的體重下降，與正常組和低劑量組比較差異有顯著性(P=0.032)。(見圖1)

注：與正常組比較，CΡ < 0.05；，與低氟鋁組比較，LΡ < 0.05。圖1 不同氟鋁劑量和暴露時(shí)間對大鼠體重的影響Note. Compared with the normal control,CP < 0.05. Compared with the low F+Al group,LP < 0.05.Figure 1 Effects of different doses and exposure time of aluminum and fluoride on the body weight of rats

2.2 不同氟鋁劑量和暴露時(shí)間對大鼠脛骨生長板厚度及細(xì)胞形態(tài)的影響

正常組90 d與45 d比較，氟鋁組G.P.Wi降低[(136.62 ± 6.54)vs(160.69 ± 8.38)，P=0.004]；低氟鋁組與正常組比較差異無顯著；高氟鋁生長板增厚，與正常對照組比較差異有顯著性[45 d組，(203.98 ± 15.66)vs(160.69 ± 8.38)，P=000；90 d組，(183.80 ± 17.59)vs(136.62 ± 6.54)，P=000)]，高氟鋁45 d和90 d組之間比較差異有顯著性(P=0.037)。但45 d組軟骨細(xì)胞層次清楚，排列整齊，形態(tài)無異常，而90 d組肥大細(xì)胞擁擠，潴留。(見圖2)

2.3 不同氟鋁劑量和暴露時(shí)間對大鼠脛骨近端骨小梁微結(jié)構(gòu)及骨代謝的影響

從表1可見，高氟鋁短期45 d組與對照組45 d比較，只有BV/TV增加。高氟鋁90 d組BV/TV則比45 d組減少，與正常組和低氟鋁組比較，則沒有顯著降低。其余指標(biāo)Tb.Th, Tb.N和Tb.Sp的改變也沒有明顯差異。

由圖3和圖4 可見，與正常同一時(shí)間段組相比，低氟鋁組、高氟鋁45 d組的MS， MAR， BFR以及Ob.S， O.S明顯增加。Oc.S只在低氟鋁90 d組和高氟鋁45 d組增加，高氟鋁90 d組的Ob.S和Oc.S比高氟鋁45 d組是明顯降低的。

圖2 不同氟鋁劑量和暴露時(shí)間對大鼠脛骨生長板厚度的影響(甲苯胺藍(lán)染色)Figure 2 Effects of different doses and exposure time of fluoride combined with aluminum on the thickness of rat tibia growth plate(Toluidine blue staining)

組別Groups周期Period(d)骨小梁面積百分率BV/TV(%)骨小梁厚度Tb.Th(μm)骨小梁數(shù)量Tb.N(#/mm)骨小梁分離度Tb.Sp (μm)對照組Control group4525.04 ± 4.1859.26 ± 4.603.54 ± 0.98221.33 ± 41.239026.62 ± 7.8562.26 ± 6.923.68 ± 0.92218.10 ± 45.99低氟鋁組Low F + Al group4527.60 ± 3.1762.56 ± 11.113.77 ± 1.28222.87 ± 27.589028.82 ± 4.6360.66 ± 9.463.56 ± 0.61226.06 ± 26.14高氟鋁組High F + Al group4529.76 ± 4.62C 66.06 ± 13.833.66 ± 0.92219.97 ± 28.349023.36 ± 3.96H4557.26 ± 8.223.00 ± 0.88282.80 ± 48.24

注：與正常對照組45天相比，CP< 0.05，與高氟鋁45天組相比，H45P< 0.05。

Note. Compared with the normal control,CP<0.05. Compared with the high F+Al group at day 45,H45P< 0.05.

注：熒光圖，黃綠色為鈣黃綠素?zé)晒猓蕉?、越亮表示成骨越活躍。圖3 不同氟鋁時(shí)間對大鼠脛骨近端小梁骨微結(jié)構(gòu)及骨代謝的影響Note. Fluorescence images, the yellow-green color is calcein fluorescence, and the more and brighter parts indicate a more active osteogenesis.Figure 3 Effects of fluoride and aluminum on bone microstructure and bone metabolism of the rat proximal tibia

注：與同一時(shí)間段正常對照組相比，CP< 0.05，CCP< 0.01；與同一時(shí)間段低氟鋁組相比，LP< 0.05，LLP< 0.01。圖4 不同氟鋁劑量和暴露時(shí)間對大鼠脛骨近端骨代謝參數(shù)的影響Note. Compared with the normal control at the same period group,CP < 0.05, CCP < 0.01. Compared with the low F+Al at the same period group,LP < 0.05, LLP < 0.01.Figure 4 Effects of different doses and exposure time of fluoride combined with aluminum on the bone metabolic parameters of the rat proximal tibia

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，高劑量氟鋁短期和低劑量氟鋁較長時(shí)間攝入對長骨生長和骨代謝的影響是不同的。低劑量氟鋁聯(lián)合攝入較長時(shí)間對骨骼沒有明顯負(fù)性作用，反而增加次級小梁骨形成。高氟鋁短期暴露刺激軟骨生長，增加次級小梁骨形成和骨吸收，長期攝入則造成軟骨成骨障礙，骨轉(zhuǎn)換抑制，最終長骨生長抑制和骨量丟失。

生長板(即骺板)中軟骨細(xì)胞的發(fā)育過程決定著長骨的生長。體外研究結(jié)果表明，氟對軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)低劑量促進(jìn)、高劑量相對抑制其功能的雙向作用[7]。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(短的60 d，長至6個(gè)月)也證實(shí)了過量氟或氟鋁造成大鼠骺板增厚，軟骨礦化延遲甚至壞死[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高氟鋁短期暴露使生長板增厚，且軟骨細(xì)胞排列整齊，層次清楚，形態(tài)正常，長期則出現(xiàn)軟骨細(xì)胞形態(tài)異常。說明了高氟鋁對軟骨細(xì)胞短期促進(jìn)，長期抑制的作用。氟和鋁都是帶電荷的離子，進(jìn)入體內(nèi)可引起細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度的改變，影響鈣的正常代謝，使軟骨基質(zhì)不能及時(shí)礦化，不能及時(shí)過渡為初級小梁骨。同時(shí)，氟鋁對軟骨細(xì)胞均有直接毒性作用。氟直接損害線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，鋁可競爭性抑制蛋白聚糖與基質(zhì)膠原結(jié)合,產(chǎn)生不成熟的軟骨基質(zhì)[10]，同時(shí)在體內(nèi)與Ca2+、Mg2+、Fe2+等陽離子產(chǎn)生競爭作用，干擾細(xì)胞的能量代謝，影響細(xì)胞正常功能。短期氟鋁暴露的情況下，體內(nèi)內(nèi)環(huán)境存在一定的代償作用，隨著時(shí)間的延長，氟鋁的毒性作用逐漸顯現(xiàn)，從而造成軟骨細(xì)胞滯留、凋亡細(xì)胞增多、礦化延遲，氟鋁對生長板軟骨細(xì)胞的影響最終表現(xiàn)為負(fù)性作用。體重的變化趨勢與軟骨細(xì)胞先促進(jìn)后抑制的表現(xiàn)是一致的，也間接說明了長期氟鋁暴露對長骨生長的抑制。

大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確成骨細(xì)胞功能活躍在氟暴露骨病變中是一個(gè)發(fā)生較早、并起主導(dǎo)作用的環(huán)節(jié)。成骨細(xì)胞被激活后，刺激了細(xì)胞內(nèi)一系列的復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的信號通路網(wǎng)絡(luò)，改變相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)，從而對成骨細(xì)胞的增殖分化，凋亡，甚至細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，礦化等產(chǎn)生影響。目前為止，幾乎所有與成骨細(xì)胞的增殖分化及功能調(diào)控相關(guān)的信號通道如Runx2、Wnt/β-catenin、BMP、PI3K/Akt、ERK/MAPK、Hedgehog、胰島素受體通道等，均被證實(shí)與氟調(diào)控成骨細(xì)胞相關(guān)[11-12]。氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)外鈣矛盾機(jī)制也參與了氟激活成骨細(xì)胞的機(jī)制[13]。而鋁對成骨細(xì)胞的功能是抑制的[14]。本實(shí)驗(yàn)中，低氟鋁短期內(nèi)只激活骨形成，也很好的印證了成骨細(xì)胞是氟鋁暴露時(shí)最先啟動(dòng)的環(huán)節(jié)，同時(shí)也說明，在高氟低鋁的聯(lián)合攝入中，短期內(nèi)仍是以氟的作用為主，或者高氟的刺激骨形成作用掩蓋了低鋁直接抑制骨形成的作用。

相對而言，氟鋁對破骨細(xì)胞的作用仍存在許多爭議的地方。有實(shí)驗(yàn)證明，低劑量的氟可以促進(jìn)體外培養(yǎng)小鼠破骨細(xì)胞增殖，隨劑量增加促進(jìn)作用減弱，高劑量氟則有抑制作用[15]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則大多發(fā)現(xiàn)破骨功能活躍，骨吸收、骨轉(zhuǎn)換均增加。但是與骨形成增加之間的關(guān)系如何，并沒有清楚的說明[16]。而鋁或氟鋁聯(lián)合對破骨細(xì)胞的影響基本未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨吸收增加是隨著骨形成的增加而增加，又隨著骨形成的降低而降低的。這說明這種骨吸收增加和骨轉(zhuǎn)換加速主要是成骨細(xì)胞過度激活后偶聯(lián)破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)的結(jié)果。成骨細(xì)胞激活后，通過趨鈣激素(主要是PTH)，以及以O(shè)PG/RANK/ RANKL分子軸為主導(dǎo)的多種細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子組成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)激活破骨細(xì)胞和加速骨轉(zhuǎn)換[17]?；蛴蛇@些細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致的微環(huán)境的改變，細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號聯(lián)接等對破骨細(xì)胞產(chǎn)生影響。

隨著暴露時(shí)間的延長，高氟鋁對軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的直接毒性作用將逐漸占據(jù)優(yōu)勢。由于氟離子的強(qiáng)氧化性，一方面產(chǎn)生自由基促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，另一方面，直接損傷DNA結(jié)構(gòu)，影響核酸代謝，對靶細(xì)胞產(chǎn)生毒性[18]。鋁(Al3+)在細(xì)胞內(nèi)也競爭與磷酸根、檸檬酸等的結(jié)合，與ATP或DNA形成絡(luò)合物，干擾能量和核酸代謝及糖代謝，抑制磷酸化反應(yīng)可導(dǎo)致多數(shù)酶和蛋白的活性改變，使細(xì)胞損傷[19]。另外，氟離子還可激活成骨細(xì)胞上的L型鈣離子通道使鈣內(nèi)流增加，引起體內(nèi)鈣離子的濃度變化[20]，繼而激活上述與鈣平衡密切相關(guān)的調(diào)控成骨細(xì)胞的信號通道。由于氟鋁與鈣、鉀、鎂等離子的競爭性抑制作用，導(dǎo)致其他非骨相損害的同時(shí)會(huì)加重骨相損害。最終造成成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能抑制，骨轉(zhuǎn)換降低，骨量丟失。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氟鋁對骨骼的影響主要還是決定于劑量高低。低劑量氟鋁較長時(shí)間暴露沒有明顯負(fù)性作用。高劑量短期雖刺激軟骨細(xì)胞發(fā)育和增加骨轉(zhuǎn)換，但隨暴露時(shí)間延長最終轉(zhuǎn)向抑制。

本實(shí)驗(yàn)不足之處在于，首先，沒有血液、尿液、骨組織中的氟鋁含量以及軟骨代謝、骨代謝指標(biāo)的測定結(jié)果，鋁的劑量過于單一，沒有單獨(dú)高氟劑量的比較，這些都將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和完整性。其次，動(dòng)物性別差異，飼料中所含鈣磷比例，蛋白含量，氟鋁含量等因素都會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和嚴(yán)謹(jǐn)性造成一定的影響。這些問題將指導(dǎo)下一步實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物模型的選擇和優(yōu)化。

(注：本實(shí)驗(yàn)開始于2013年，實(shí)驗(yàn)周期2年，2015年實(shí)驗(yàn)完成。由于實(shí)驗(yàn)涉密問題，于2018年完成撰寫投稿。)