經(jīng)腸道播散誘導(dǎo)內(nèi)源性感染小鼠模型的建立及評價

葉先飛，陳麗，王若南，葛超榮，陳瑜

(浙江省臨床體外診斷技術(shù)研究重點實驗室，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科， 杭州 310003)

近年來臨床上各種惡性腫瘤和免疫功能低下人群不斷增加，隨之而來的是廣譜抗生素、免疫抑制劑、化療、放療以及器官移植等醫(yī)療手段的廣泛使用，導(dǎo)致這些免疫功能低下患者腸道微生態(tài)出現(xiàn)失衡，破壞了正常菌群對腸黏膜的定植保護(hù)作用，為條件性致病菌的大量定植和腸外播散創(chuàng)造了條件，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)源性感染[1]。臨床治療過程中，內(nèi)源性感染是常見并發(fā)癥，已成為引起患者死亡的主要高危因素[2-3]。目前的動物感染模型研究中多為機(jī)體正常狀態(tài)下通過靜脈、腹腔或者口腔方式感染[4-5]，而模擬機(jī)體免疫抑制或腸道菌群紊亂狀態(tài)時通過腸道菌群播散引起的內(nèi)源性感染卻不多見。前期研究中我們分析了惡性血液病患者真菌感染的危險因素[6]，在此基礎(chǔ)上我們通過模擬該類患者發(fā)生感染的危險因素構(gòu)建經(jīng)腸道播散誘導(dǎo)內(nèi)源性感染的動物模型并初步評價，為后續(xù)實驗研究提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6周齡SPF級ICR雌性小鼠24只，體重22～25 g，每組8只。小鼠來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】，實驗在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動物實驗中心進(jìn)行【SYXK(浙)2013-0180】，全部飼養(yǎng)于小鼠獨立通氣籠內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25℃，濕度50%～70%，小鼠在實驗前適應(yīng)環(huán)境1周。墊料、飼料和飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌后使用。動物實驗開展經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批(2017實動快審第593)。

1.1.2 實驗菌株及菌體懸液配置

白假絲酵母菌(C.albicans)#5菌株由美國加利福尼亞醫(yī)學(xué)研究中心Karl V. Clemons教授惠贈。無菌操作下，將-80℃冰箱中保存有白假絲酵母菌#5菌株的紙片剪下一片貼在沙堡顯色培養(yǎng)基上，并在紙片上滴加500 μL沙氏培養(yǎng)液浸潤，35℃培養(yǎng)48 h。挑取復(fù)蘇后的菌落進(jìn)一步在液體沙氏培養(yǎng)液中增菌培養(yǎng)36 h，4000 r/min離心7 min，棄上清，生理鹽水洗滌兩次后收集菌液，加入滅菌雙蒸水配制成1×109cells/mL菌液。

1.1.3 主要溶液配制

口服抗生素溶液為含有1 mg/mL口服型鹽酸萬古霉素、1 mg/mL鹽酸克林霉素和0.2 mg/mL硫酸慶大霉素的混合溶液，免疫抑制劑為濃度10 mg/mL的5-FU注射液。所用實驗溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理

實驗全程共18 d，模型組A小鼠第0天開始飲用抗生素溶液至第7天結(jié)束，第8天時尾靜脈注射5-FU，劑量為200 mg/kg，共1次。模型組B在第9、10天時禁食禁水8 h后給予0.3 mL白假絲酵母菌懸液灌胃，共兩次。對照組同樣方法給予生理鹽水飲用、尾靜脈注射以及灌胃處理。

1.2.2 糞便涂片染色

分別收集小鼠抗生素溶液處理前、處理后、化療藥物處理后、白假絲酵母菌灌胃處理后四個階段的糞便，參照張秀榮《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》[7]對小鼠糞便進(jìn)行涂片后革蘭染色，每個染色標(biāo)本油鏡下分別計數(shù)3個視野下的革蘭陽性桿菌、革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌、革蘭陰性球菌和酵母樣菌的大致比例，以了解其腸道菌群狀態(tài)。

1.2.3 糞便/組織器官載菌量檢測

模型組B小鼠在給予白假絲酵母菌灌胃處理后第2天開始，每隔一天收集小鼠糞便進(jìn)行白假絲酵母菌載量培養(yǎng)，觀察其在小鼠腸道內(nèi)的載量變化。方法如下：糞便顆粒稱重后加入1 mL無菌生理鹽水，使用無菌玻璃研磨管將其研磨成組織勻漿，將勻漿進(jìn)行一系列梯度稀釋，分別取100 μL均勻涂布于沙堡顯色培養(yǎng)基上，每個濃度做2個平行板，35℃培養(yǎng)48～72 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，各稀釋度平板上菌落個數(shù)為30～300 CFU為宜，載菌量以log(CFU/g)表示。小鼠解剖后肺、肝臟和腎組織的細(xì)菌和真菌定量方法同上，分別接種于血平板和沙堡顯色培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.2.4 腸道菌群定量測定

分別提取大腸桿菌、雙歧桿菌和糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，根據(jù)腸桿菌屬、雙歧桿菌屬和腸球菌屬基因保守區(qū)域設(shè)計特異性PCR引物，并在BLAST基因庫中對所設(shè)計引物進(jìn)行特異性分析。引物序列如下：Enterobacteriaceae(F: CATTGACGTTACC CGCAGAAGAAGC; R: CTCTACGAGACTCAAGCTT GC)，Bifidobacterium(F: CGCGTCY*GGTGTGA AAG; R: CCCCACATCCAGCATCCA)(Y*為簡并堿基，代表C/T)，Enterococcus(F: AGAAATTCCA AACGAACTTG; R: CAGTGCTCTACCTCCATCAT T)。經(jīng)過PCR、電泳、膠回收、T-A克隆、測序、提取質(zhì)粒、質(zhì)粒定量、倍比稀釋為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行熒光定量PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。糞便DNA提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，51504)，嚴(yán)格按照操作說明提取糞便核酸。熒光定量PCR反應(yīng)體系總量20 μL，包括：SYBR Premix Ex TaqⅡMix(2×)10 μL，ROX DyeⅡ 0.08 μL，Primer F+R (5 μmol/L) 1.60 μL，ddH2O 6.32 μL，糞便DNA 2.00 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后，對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行充分延伸并分析熔解溫度曲線：95℃ 15 s、60℃ 1 min, 然后以1℃/min速率從60℃升溫至95℃，期間持續(xù)采集熒光強(qiáng)度。每次熒光定量反應(yīng)均以標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，每份標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品同時做3個復(fù)孔，并同時設(shè)置陰性對照孔，每次PCR反應(yīng)完畢后根據(jù)溶解曲線分析產(chǎn)物的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出CT值及各菌屬總量，將所測得細(xì)菌載量值進(jìn)行l(wèi)og對數(shù)轉(zhuǎn)換后獲得對數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計分析。定植抗力指標(biāo)B/E表示腸道正常菌群所提供的對感染的保護(hù)作用，為雙歧桿菌屬與腸桿菌屬的數(shù)量比值。

1.2.5 組織切片制作及HE染色

實驗終點解剖小鼠進(jìn)行載菌量檢測的同時，各取部分小鼠組織進(jìn)行組織固定，再按照脫水→透明、透蠟→石蠟包埋→切片→染色→脫水→封固的步驟進(jìn)行病理切片及染色制作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，用獨立樣本t檢驗比較各組與對照組間的差異，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗。生存分析比較用Kaplan-Meier法檢驗，P< 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體征和生存分析

給予抗生素溶液飲用7 d后，兩模型組小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，表現(xiàn)為糞便稀松不成形。12 d開始兩模型組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)感染癥狀，表現(xiàn)為攝食減退、被毛凌亂、蜷縮少動等體征，并有不同程度的死亡，其中模型組B死亡率較高(圖1)。

圖1 各組小鼠生存率分析曲線Figure 1 Survival curves of the mice in each group

2.2 小鼠各實驗階段糞便菌群變化

糞便涂片革蘭染色顯示，抗生素溶液飲用前小鼠糞便中布滿大量G+桿菌和G-桿菌，其間散在分布G+球菌(圖2a)。飲用抗生素溶液7 d后，G+桿菌和G-桿菌明顯減少，G+球菌有所增加(圖2b)。接受5-FU化療處理后1 d， G+桿菌和G-桿菌數(shù)量進(jìn)一步減少，G+球菌大量增加(圖2c)。接受白假絲酵母菌灌胃處理后2 d模型組B小鼠糞便中出現(xiàn)大量的酵母樣真菌，部分呈現(xiàn)菌絲相(圖2d)。

注：a. 無處理；b. 抗生素溶液飲用7 d后；c. 5-FU尾靜脈注射1 d后；d. 白假絲酵母菌灌胃2 d后。圖2 小鼠不同處理后糞便菌群變化結(jié)果(革蘭染色，×100倍)Note. a. No treatment. b. Antibiotic solution for 7 d. c. One day after the i.v.injection of 5-FU. d.Two days after intragastric gavage of C. albicans.Figure 2 Changes of the fecal flora in mice after different treatments (Gram staining, ×100)

2.3 模型組B小鼠糞便白假絲酵母菌載量變化

實驗第11天開始，模型組B小鼠白假絲酵母菌灌胃后每隔一天糞便培養(yǎng)結(jié)果顯示，白假絲酵母菌載量逐漸減少，但平均載量都保持在250×104CFU/mg以上(圖3)。

圖3 模型組B小鼠糞便白假絲酵母菌載量變化Figure 3 Changes in the load of fecal C. albicans in the mice of model group B

2.4 小鼠組織器官培養(yǎng)結(jié)果

實驗終點時解剖各組小鼠，無菌條件下進(jìn)行肝、腎和肺組織研磨后培養(yǎng)并計數(shù)載菌量，結(jié)果顯示對照組C小鼠器官組織未發(fā)生細(xì)菌和真菌感染，兩模型組A和B均發(fā)生了不同程度的細(xì)菌感染，載菌量在103～105CFU/g數(shù)量級，不同器官細(xì)菌載量均無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4a、4b)，提示兩組小鼠均出現(xiàn)系統(tǒng)性細(xì)菌感染。模型組B同時檢測出白假絲酵母菌感染，載菌量在103～104CFU/g數(shù)量級，不同器官白假絲酵母菌載量無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4c)，提示該組小鼠出現(xiàn)系統(tǒng)性真菌感染。

注：a. 模型組A細(xì)菌載菌量；b. 模型組B細(xì)菌載菌量；c. 模型組B白假絲酵母菌載菌量。圖4 模型組小鼠肝臟、腎和肺的載菌量Note. a. Bacterial load of the model group A. b. Bacterial load of the model group B. c. C. albicans load of the model group B.Figure 4 Bacterial/fungi loads in the liver, kidney and lung of mice in the model groups

圖5 對照組和模型組小鼠病理改變(HE染色)Figure 5 Pathological changes in the organs of the mice of control and model groups(HE staining)

2.5 小鼠臟器的病理檢查結(jié)果

發(fā)生感染的兩模型組與對照組小鼠組織切片HE染色顯示：兩模型組小鼠肺泡壁毛血細(xì)管擴(kuò)張，血細(xì)胞大量滲出至肺泡腔，間質(zhì)中炎癥細(xì)胞彌散性浸潤。肝細(xì)胞水腫，體積變大，胞質(zhì)疏松化和氣球樣變，肝竇受壓變窄甚至消失。盲腸和大腸黏膜絨毛間隙明顯增大，黏膜細(xì)胞脫落壞死，杯狀細(xì)胞少見，黏膜肌層變薄(圖5)。

2.6 小鼠腸道菌群定量結(jié)果

實驗終點時小鼠盲腸糞便DNA定量PCR結(jié)果如表1所示，與對照組C相比，模型組A和B腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，主要表現(xiàn)為雙歧桿菌屬數(shù)量顯著下降，腸桿菌屬數(shù)量顯著增加，腸道定植抗力指標(biāo)B/E值小于1，說明兩模型組小鼠腸道均出現(xiàn)了菌群微生態(tài)失衡。

表1 各組小鼠盲腸糞便DNA定量值Table 1 Quantitative values of cecal fecal DNA of the mice in each group

注：模型組A、B分別與對照組C比較，*P< 0.05；**P< 0.001。B/E>1為正常范圍，<1表示腸道定植抗力下降。

Note. The model group A and B were compared with the control group C, respectively.*P< 0.05,**P< 0.001. B/E >1 is the normal range, <1 means the decreased intestinal colonization resistance.

3 討論

我國抗生素濫用現(xiàn)象較為嚴(yán)重，而抗生素的濫用會引起腸道微生態(tài)失衡，臨床在治療基礎(chǔ)疾病的同時極易繼發(fā)內(nèi)源性感染，嚴(yán)重者可觸發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致膿毒血癥和多臟器功能衰竭，甚至死亡[8]。目前的抗生素抗感染策略已經(jīng)不能完全解決感染的難題，感染性疾病的防控與治療亟需新的理論和方法。近年來，隨著感染微生態(tài)概念和理論的提出，人們認(rèn)識到腸道微生態(tài)失衡與內(nèi)源性感染密切相關(guān)。因此，本實驗擬建立的內(nèi)源性感染動物模型將為從微生態(tài)方面探索內(nèi)源性感染機(jī)制及抗感染途徑提供動物模型基礎(chǔ)。

腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障和化學(xué)屏障構(gòu)成，在防御腸道內(nèi)病原體侵襲中發(fā)揮重要作用，而腸道是人體最大的“儲菌器官”，微生態(tài)學(xué)已經(jīng)證明腸道菌群失調(diào)是多器官功能紊亂和衰竭的始動器[9]。研究采用廣譜抗生素混合溶液喂養(yǎng)ICR小鼠后出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便涂片染色發(fā)現(xiàn)腸道菌群G+桿菌和G-桿菌明顯減少，G+球菌相應(yīng)增加，與對照組比較發(fā)生了較為明顯的菌群紊亂。該步抗生素處理破壞了腸道微生物屏障，為小鼠內(nèi)源性感染的發(fā)生創(chuàng)造了先決條件。

既往研究發(fā)現(xiàn)使用SCID免疫缺陷型小鼠造模，可出現(xiàn)黏膜嚴(yán)重感染，很少發(fā)生系統(tǒng)性感染[10-11]。同樣的，使用特定基因敲除小鼠造模也只局限于局部黏膜感染而不能造成系統(tǒng)性感染[12]。因此，我們推測完整的黏膜屏障在抑制致病菌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。已有研究表明免疫抑制劑的使用不僅導(dǎo)致免疫力低下，還可以造成腸道黏膜的破壞，使腸道機(jī)會性致病菌(如革蘭陰性菌、白假絲酵母菌)穿過受損的黏膜造成系統(tǒng)性感染[13]。本研究采用免疫功能正常的ICR小鼠，在口服飲用抗生素溶液的基礎(chǔ)上給予尾靜脈注射5-FU，隨后檢測到多臟器細(xì)菌系統(tǒng)性感染。結(jié)合盲腸和大腸病理切片中黏膜生理屏障被破壞以及定量PCR顯示的菌群紊亂，可以認(rèn)為免疫抑制劑的使用為小鼠腸道致病菌經(jīng)黏膜易位播散發(fā)生內(nèi)源性感染提供便利通道。

白假絲酵母菌是常見的條件致病菌，人體腸道定植的白假絲酵母菌被認(rèn)為是內(nèi)源性白假絲酵母菌感染的主要途徑。Clemons等[14]給予小鼠免疫抑制劑和全程抗菌藥物處理后小鼠出現(xiàn)了白假絲酵母菌播散性感染。本研究在模型組A的基礎(chǔ)上引入白假絲酵母菌，隨后糞便涂片顯示有菌絲相生成，連續(xù)檢測糞便白假絲酵母菌載量顯示其始終維持在較高水平。此外，該組小鼠內(nèi)臟器官真菌培養(yǎng)發(fā)生了白假絲酵母菌感染，綜合分析說明模型組B小鼠發(fā)生了內(nèi)源性真菌感染。與Clemons模型結(jié)果不同的是，我們的實驗中模型組B小鼠器官是細(xì)菌和白假絲酵母菌混合感染，可能的原因是我們僅在實驗的前7 d給予抗生素溶液飲用，并未全程飲用，在撤掉抗生素后內(nèi)源性細(xì)菌感染不能得以有效控制。此外，研究中發(fā)現(xiàn)混合感染使該模型組B小鼠的死亡率高于模型組A，而該情況與臨床此類患者真菌感染高死亡率現(xiàn)象吻合[15]。

研究中不足的是，在器官組織培養(yǎng)時未進(jìn)行厭氧菌培養(yǎng)計數(shù)，而腸道又是厭氧菌的“貯菌庫”，因此實際上器官組織的載菌量要高于本研究中的計數(shù)值。

綜上所述，本實驗證實了腸道病原體在小鼠腸道菌群失調(diào)及免疫抑制條件下可突破腸黏膜屏障引起內(nèi)源性器官組織感染，為腸道微生態(tài)與內(nèi)源性感染的相關(guān)機(jī)制研究提供了模型基礎(chǔ)。