銀杏葉提取物的長期毒性研究

季 遷李 哲李 敏劉 芳姜殿軍

（1 沈陽醫(yī)學院，遼寧 沈陽 100034；2 沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110034）

銀杏葉提取物的長期毒性研究

季 遷1李 哲2李 敏1劉 芳2姜殿軍1

（1 沈陽醫(yī)學院，遼寧 沈陽 100034；2 沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110034）

目的 選用高于臨床擬用劑量30倍和120倍的劑量組進行“限度實驗”觀察其長期毒性作用。方法 將90只Wister大鼠隨機分3組，即生理鹽水對照組，銀杏葉提取物低、高劑量組，灌胃給藥24周后檢測血液學和血液生化指標，同時解剖并摘取各組織臟器，計算臟器系數(shù)，進行病理學檢查分析。結(jié)果 與對照組比較，銀杏葉提取物高、低劑量組大鼠的臟器系數(shù)未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），但多項血液學指標和血液生化指標發(fā)生顯著改變。結(jié)論 用滲漉法制備的銀杏葉提取物對大鼠有降血脂、抗血栓作用，長期大劑量使用可顯著改變多項血液學和血液生化指標，還可能引起消化性潰瘍與腫瘤。

銀杏葉提取物；長期毒性

隨著對銀杏葉的化學成分和藥理作用的深入研究，證實銀杏葉提取物對多種疾病有確切的治療作用，尤其在防治心腦血管疾病方面被廣泛開發(fā)應(yīng)用。

本實驗用滲漉法制備銀杏葉提取物，并選用高于臨床擬用劑量30倍和120倍銀杏葉提取物的低、高劑量組長期給藥，進行“限度實驗”，觀察銀杏葉提取物是否具有毒副作用。通過系統(tǒng)的毒理學研究，為確定其最大安全劑量，指導臨床用藥和制藥企業(yè)控制銀杏葉產(chǎn)品質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要藥品和試劑：銀杏葉、蒸餾水、生理鹽水、無水乙醇、丙酮、甲醛、烏拉坦。

主要器材及物品：滲漉器（沈陽醫(yī)學院藥理教研室提供）；全自動血液分析儀（美國BECKMAN COULTER Gen.S）；全自動生化分析儀（日本日立公司）；冰凍病理切片機（德國SLEE公司）；顯微鏡（美國VSI公司）；SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件等。

動物：Wister大鼠90只（體質(zhì)量60～70 g），雌雄各半，由沈陽醫(yī)學院動物實驗中心提供（動物合格證：SCSK，遼2003-0016）。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏葉提取物的制備

按正規(guī)流程操作，制備銀杏葉滲漉液，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收得浸膏，用丙酮溶解，冰水浴下超聲波分散，室溫靜置24 h，過濾后揮發(fā)丙酮，即得銀杏葉粗提物。

1.2.2 銀杏葉提取物的長期毒性試驗

1.2.2.1 實驗分組：將90只Wister大鼠隨機分為3組，每組雌雄各半。即生理鹽水對照組、低劑量組和高劑量組。

1.2.2.2 給藥方式：每天早晚各1次灌胃給藥，共24周。低劑量組：按1.03 g/（kg·d）劑量，相當于人臨床日劑量的30倍。高劑量組：按4.12 g/（kg·d）劑量，相當于人臨床日劑量的120倍。生理鹽水對照組：將生理鹽水按照20 mL/（kg·d）劑量。

1.2.2.3 觀察指標

①綜合指標觀察：包括動物外觀體征、行為活動和糞便性狀等。每天給藥前稱重，再定量給藥，并計算平均食物攝入率。實驗過程中若有動物死亡及時解剖，觀察、推測死亡原因。在末次給藥后，禁食15 h，不禁水，稱重。②血液學和血液生化指標觀察：烏拉坦麻醉，腹腔主動脈采血，每只動物采3 mL全血不加抗凝劑，2 mL全血加0.15 g枸櫞酸鈉抗凝，供檢測。③采血后解剖實驗大鼠，摘取主要臟器稱重，計算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量）。并做病理切片，進行病理學檢查分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 對動物一般體征影響

給藥過程中，高、低劑量組動物毛色光澤逐漸消失，食物攝入量顯著減少。其中高劑量組部分動物腹部脹大，觸有腫塊。給藥2個月后，高、低劑量組動物體質(zhì)量明顯減輕，高劑量組動物出現(xiàn)死亡。經(jīng)解剖觀察，推測動物死于消化系統(tǒng)潰瘍穿孔。

2.2 臟器系數(shù)的改變

給藥24周后，將動物麻醉，解剖并取出主要臟器，測定臟器系數(shù)結(jié)果見表1。與生理鹽水對照組相比較，P＞0.05。

2.3 血液學指標的改變

服用銀杏葉24周后，高、低劑量組大鼠的血液學指標有多項發(fā)生顯著的改變。其中，中性粒細胞百分比，單核細胞百分比、嗜酸細胞百分比、嗜堿細胞百分比、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、紅細胞容積和血小板計數(shù)顯著降低（P＜0.01），而淋巴細胞百分比和血小板平均體積則顯著增加（P＜0.01），見表2。

2.4 血液生化指標的改變

服用銀杏葉24周后，高、低劑量組大鼠的血液生化指標有多項發(fā)生顯著的改變。其中，尿素、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總蛋白、白蛋白和肌酸磷酸激酶水平顯著下降（P＜0.01）；凝血酶原時間顯著延長（P＜0.01）；血鉀降低，血鈉升高（P＜0.01），但血氯水平改變不顯著（P＞0.05）。見表3。

表1 不同劑量銀杏葉對大鼠臟器系數(shù)的影響[()，mg/g]

表1 不同劑量銀杏葉對大鼠臟器系數(shù)的影響[()，mg/g]

注：與對照組相比較*P＞0.05

組別 心 肝 脾 肺 腎 腎上腺 胸腺 子宮 睪丸 腦對照組 5.3±0.3 43.7±6.6 3.5±1.2 10.8±2.0 7.7±1.3 0.3±0.1 1.3±0.6 1.9±0.6 11.0±1.2 8.3±0.8低劑量組 5.0±1.1* 42.9±10.3* 4.4±2.8* 10.0±8.7* 7.5±5.0* 0.3±0.1* 1.3±0.3* 2.0±0.5* 10.5±1.3* 8.1±1.8*高劑量組 4.6±0.8* 41.6±5.4* 3.9±2.1* 10.2±1.0* 6.6±0.6* 0.4±0.1* 0.9±0.4* 1.2±0.9* 11.1±1.9* 7.8±1.3*

表2 不同劑量銀杏葉對大鼠血液學指標的影響（）

表2 不同劑量銀杏葉對大鼠血液學指標的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01；●P＜0.01

血液學指標 對照組 低劑量組 高劑量組白細胞計數(shù)(109/L) 14.83±80.08 13.68±15.32 15.01±8.76中性粒細胞百分比(%) 21.63±7.19 20.92±14.29* 11.26±4.97*淋巴細胞百分比(%) 62.93±12.74 66.20±2.33● 78.66±7.32●單核細胞百分比(%) 10.59±3.89 8.54±3.90* 6.28±2.54*嗜酸細胞百分比(%) 1.88±0.95 1.82±0.89* 1.18±1.07*時間細胞百分比(%) 0.94±0.55 0.87±0.60* 0.62±0.13*紅細胞計數(shù)(1012/L) 6.58±1.68 5.16±1.59* 4.52±1.50*血紅蛋白含量(g/L) 105.44±19.82 104.56±20.62* 71.40±22.12*紅細胞比容(%) 0.32±0.07 0.33±0.07* 0.22±0.07*平均紅細胞體積(fL) 49.50±3.84 49.31±3.70 49.40±2.10平均紅細胞血紅蛋白含量(pg) 16.36±2.32 15.88±1.94 15.94±0.74平均紅細胞血紅蛋白濃度(g/L) 329.33±26.77 321.33±21.70 322.60±15.98紅細胞分布寬度(%) 14.26±1.39 ±14.53±1.68 14.12±1.30血小板計數(shù)(109/L) 559.8±142.10 529.44±191.14* 431.80±146.69*血小板平均體積(fL) 5.95±0.19 6.02±0.23● 6.58±0.82●網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(109/L) 4.34±1.89 5.11±2.19 5.09±2.23

2.5 大鼠臟器的病理學改變

圖1 大鼠腸黏膜上疑似淋巴瘤

表3 不同劑量銀杏葉對大鼠血液生化指標的影響（）

表3 不同劑量銀杏葉對大鼠血液生化指標的影響（）

注：與對照組比較*P＜ 0.01；●P＜ 0.01；○P＞0.05

血液生化學指標 對照組 低劑量組 高劑量組尿素(mmol/L) 11.59±1.19 7.36±1.31* 6.86±1.22*肌酐(μmol/L) 37.08±2.57 28.40±8.64* 25.13±4.45*三酰甘油(mmol/L) 0.92±0.07 0.67±0.15* 0.57±0.18*總膽固醇(mmol/L) 1.99±0.16 1.29±0.21* 1.32±0.34*

服用銀杏葉24周，高劑量組大鼠中有85 %出現(xiàn)肉眼可見的胃或十二指腸潰瘍，有50 %腹腔中腸黏膜上出現(xiàn)腫瘤，有的長徑可達6 cm，腫瘤及其病理切片如圖1、2所示。腫瘤組織細胞呈卵圓形，有典型的濾泡中心細胞樣腫瘤細胞，為腸黏膜淋巴瘤。

圖2 淋巴瘤病理切片（HE染色，×400）

3 討 論

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，銀杏葉提取物中富含天然的藥理活性成分黃酮苷和銀杏內(nèi)酯，大量實驗和臨床研究表明這些活性成分具有明顯的抑制血小板聚集作用[1]。

目前，有關(guān)銀杏葉制劑的毒性研究報道很多，基本結(jié)論是安全可靠，外觀體征、行為活動、體質(zhì)量增長均無異常變化；血液學和血液生化學檢查均在正常范圍；組織病理學檢查未見明顯異常。但有關(guān)研究所采用的劑量較小，大鼠的平均治療劑量為34 mg/kg，也許不能完全反映出藥品的毒性。本實驗選用兩個高于臨床擬用劑量30倍和120倍的劑量組，進行限度實驗。結(jié)果表明，大鼠服用銀杏葉提取物24周后，高、低劑量組的血液學和血液生化學指標有多項發(fā)生非常顯著的改變。其中，中性粒細胞百分比，單核細胞百分比、嗜酸細胞百分比、嗜堿細胞百分比、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、紅細胞容積和血小板計數(shù)顯著降低（P＜0.01），而淋巴細胞百分比和血小板平均體積則顯著增加（P＜0.01）；尿素、肌酐、三酰甘油、總膽固醇、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總蛋白、白蛋白肌和酸磷酸激酶水平顯著下降（P＜0.01）；凝血酶原時間顯著延長（P＜0.01）；血鉀降低，血鈉升高（P＜0.01），但血氯水平改變不顯著（P＞0.05）。

各臟器系數(shù)與正常對照組比較P＞0.05，無顯著差異，表明各主要臟器未發(fā)生顯著萎縮或退行性改變。但高劑量組大鼠中產(chǎn)生了消化性潰瘍和腫瘤，病理組織學檢查結(jié)果顯示，腫瘤組織細胞呈卵圓形，有典型的濾泡中心細胞樣腫瘤細胞，疑為腸黏膜淋巴瘤。銀杏葉提取物中含有銀杏酸，它是國內(nèi)外公認的潛在致敏物質(zhì)，可引起消化道黏膜過敏反應(yīng)，降低黏膜屏障作用，導致消化性潰瘍。但存在于銀杏葉提取物中致使腫瘤形成的具體毒性成分，尚待研究。余啟枝等[2]證實對犬每日按80 mg/kg靜脈滴注3個月，腎臟部分腎小管上皮細胞顆粒變性、空泡變性。

本實驗結(jié)果表明，大鼠長期大劑量使用銀杏葉提取物，能降血脂、抗血栓形成，但有可能引起消化性潰瘍與腫瘤，同時可使多項血液學和血液生化指標發(fā)生顯著改變。

[1] Zhinden S,Seiler CH.Phytotherapy in cardiovascular medicine[J]. Ther Umsch,2002,59(6):301-306.

[2] 余啟枝,王政榮,張同輝,等.注射用銀杏內(nèi)酯B毒性試驗研究[J].中國藥師,2011,14(11):1629-1632.

R282.71；R-33

：B

：1671-8194（2014）04-0055-02