彝族“黃藥”艾納香中黃酮的提取工藝優(yōu)選研究

杜麗潔 黃火強(qiáng) 張亞琛

【摘 要】 目的：優(yōu)選艾納香中總黃酮的提取工藝。方法：以乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)為因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)選提取工藝。結(jié)果：最佳條件為用16倍量的50%乙醇，提取3次，每次1.5h。結(jié)論：優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、合理，可用于艾納香中總黃酮的提取。

【關(guān)鍵詞】 艾納香;總黃酮;正交試驗

【中圖分類號】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）1-0027-04

Abstract：Objective To optimize the extraction process of total flavonoids from Huang Yao（Blumea balsamifera DC.）of Yi Nationality.Methods With the concentration of ethanol， extraction time， ratio of material to liquid and extraction times as the factors， the extraction rate of total flavonoids was used as the index， and the extraction process was optimized by orthogonal test. Results The optimal conditions were as follows： 16 times the amount of 50% ethanol， extracted 3 times， each time 1.5h. Conclusion? The preferred process is stable and reasonable and can be used for the extraction of total flavonoids from Ayurveda.

Keywords： Blumea Balsamifera DC.; Total Flavonoids;Orthogonal Test

彝族“黃藥”的中藥名為艾納香，又稱為大風(fēng)艾、牛耳艾、大骨風(fēng)、冰片艾等，為菊科艾納香屬植物艾納香（BLumea baLsamifera DC.）全草[1]，主要分布在云南、貴州、廣西、廣東等地[2]。艾納香最早記載于公元741年陳藏器所編著的《本草拾遺》：“主癬避蛇”，由于療效確切，在歷代本草等相關(guān)文獻(xiàn)中均有關(guān)于艾納香用途、用法及療效等方面的記載[3]。艾納香以其全草或地上部分入藥，其性味苦、溫、辛，主要有祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)、消腫止痛等功效[4]。彝醫(yī)認(rèn)為其性味苦，入脾、肺氣路，有清熱解毒、逐瘀化痰的功效，在中國西南彝族地區(qū)被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤，尤以抗肺癌效果為佳[5]。

文獻(xiàn)報道，艾納香的主要成分為黃酮和揮發(fā)油，同時也含有少量的苷類成分，其中黃酮類成分的研究最為廣泛。目前報道的黃酮類物質(zhì)主要為黃酮（醇）類、二氫黃酮類和查爾酮類三大類[6-10]。其藥理作用也主要集中在黃酮類物質(zhì)的作用上，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎以及保肝等活性[11-13]。為合理利用彝族“黃藥”艾納香植物中的黃酮類化合物，需要優(yōu)化對其進(jìn)行最大化提取分離的方法。目前已有學(xué)者對“黃藥”艾納香的總黃酮提取工藝和含量測定進(jìn)行了考察，黃永林等[14]采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，對艾納香葉、小枝條、莖中總黃酮含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示葉中總黃酮含量最高為2.94%，小枝條含量最低只有1.21%。羅夫來等[15]用紫外分光光度法測定總黃酮含量，以提取率為指標(biāo)，用正交實驗方法優(yōu)選艾納香最佳提取工藝。和銀霞等[16]用超聲波提取方法考察了艾納香的提取工藝，并測定不同部位總黃酮的含量。課題組前期研究結(jié)果[17]表明，艾納香的黃酮成分主要富集在二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位。本研究在羅夫來等[15]研究基礎(chǔ)上考察了提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響，并利用正交設(shè)計實驗選取乙酸乙酯萃取部位對彝族“黃藥”艾納香中總黃酮進(jìn)行考察，以期找到最佳的提取工藝，為更好地開發(fā)利用艾納香并發(fā)揮其藥用價值提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 AdventurerOHAUS電子天平，UV1700PC紫外可見分光光度計（上海鳳凰光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材 “黃藥”為菊科艾納香屬植物艾納香的干燥莖、葉，購自河北安國藥材市場，經(jīng)DNA條形碼鑒定為真品。

1.3 試劑 蘆丁對照品（北京百靈威科技有限公司）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。

2 方法

2.1 艾納香中總黃酮測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品15.1mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得到0.151mg/mL對照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密 吸取蘆丁對照品溶液0、1、2、4、6、8mL，分別置于25mL的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min;10% AL（NO3）3溶液1mL，搖勻，放置6min;4% NaOH溶液10mL，搖勻，靜置15min，加水至相應(yīng)刻度。在510nm處測定各溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度對吸光度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=11.278C+0.0275，R2=0.9992。表明蘆丁在0.00604～0.04832mg/mL與吸光度線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取艾納香藥材2.0g，根據(jù)正交試驗設(shè)計用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇按不同的料液比、不同的加熱時間以及不同加熱次數(shù)進(jìn)行回流提取，濾過，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0mg置于25mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液（濃度為1mg/mL）待用。

2.1.4 精密度試驗 稱取艾納香藥材2.0g，用80%的乙醇按料液比為15∶1加熱回流3次，每次3h，收集濾液，減壓濃縮成浸膏。將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉。精密稱取萃取物干粉25.0mg置于25mL容量瓶中，充分溶解后，做供試品溶液待用。精密量取2mL供試品置于25mL容量瓶中，按“2.1.2”項下處理，測定吸光度，連續(xù)測定5次，計算吸光度RSD值為0.515%，表明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 稱取同一批艾納香藥材5份，按“2.1.4”項下制備供試品溶液，精密量取2mL供試品置于25mL容量瓶中，其余的步驟按“2.1.2”項下方法進(jìn)行顯色處理，測定吸光度值，結(jié)果吸光度值得RSD值為1.035%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密量取2mL供試品置于25mL容量瓶中，其余步驟按“2.1.2”項下方法加顯色劑顯色進(jìn)行處理，分別在0、5、10、15、20、25、30min測定其吸光度值，計算RSD值為0.5627%，樣品在30min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7 加樣回收率試驗 稱取同一批艾納香藥材1.0g，按“2.1.4”項下制備供試品溶液，精密量取5份2mL供試品溶液置于25mL容量瓶中，分別加入0.151mg/mL的蘆丁對照品2mL，其余的步驟按“2.1.2”項下方法進(jìn)行顯色處理，測定吸光度值，結(jié)果平均回收率為97.3%，RSD值為0.753%。

2.1.8 總黃酮的測定 取艾納香藥材按“2.1.3”制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法進(jìn)行顯色處理，測定吸光度值，代入回歸方程，計算總黃酮的含量。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 對乙醇濃度設(shè)5個濃度梯度即40%、50%、60%、70%、80%。精密稱取艾納香全草2.0g，置于100mL三角瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇 40mL，70 ℃水浴回流提取3次，每次 2h，提取液過濾，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25mg置于25mL容量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項下方法顯色后，測吸光度，根據(jù)“2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線”回歸方程計算總黃酮含量和提取率。

由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度小于 50% 時，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮提取率程增加趨勢; 當(dāng)乙醇濃度為 50% 時，總黃酮提取率最高; 此后，再增加乙醇濃度，總黃酮提取率反而下降，因此，確定乙醇濃度為 50% 左右較為合適。

2.2.2 提取時間對總黃酮提取率的影響 考察提取時間的影響，設(shè)置5個時間梯度，即0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h。精密稱取2.0g艾納香全草，置于100mL 三角瓶中，加50 %乙醇 40mL，70 ℃ 水浴回流至規(guī)定時間，提取液過濾，共提取3次，合并濃縮得浸膏，將浸膏用蒸餾水超聲混懸，在堿性條件下用石油醚萃取，棄去石油醚部位，將水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮后凍干得到萃取物干粉，精密稱取萃取物干粉25mg置于25mL容量瓶中，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項下方法顯色后，測吸光度，根據(jù)“2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線”回歸方程計算總黃酮含量和提取率。

由圖3可知，當(dāng)提取時間小于1.5h時，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率程增加趨勢;當(dāng)提取時間為1.5h左右時，總黃酮提取率最高;此后，再延長提取時間，總黃酮提取率反而略微下降。因此，確定提取時間為1.5h左右較為合適。

2.3 因素水平的選擇 根據(jù)預(yù)實驗以及相關(guān)文獻(xiàn)研究選取影響艾納香回流提取的乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）為考察因素，選用L9（34）正交試驗表篩選最佳工藝。見表1。

2.4 正交試驗 取艾納香藥材2g，按照設(shè)計的實驗方案進(jìn)行提取，濾過，減壓濃縮得浸膏，浸膏水溶液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，濃縮凍干成干粉。稱取相應(yīng)質(zhì)量的萃取物粉末，配置成供試品溶液，測定其吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算艾納香總黃酮百分含量。以該結(jié)果列入正交設(shè)計表中進(jìn)行統(tǒng)計。

2.5 驗證試驗 稱取3份艾納香藥材各2g，按照上述優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行提取，萃取得到萃取物干粉，照上述建立的測定方法條件測定，計算艾納香藥材中總黃酮提取率。結(jié)果艾納香藥材中總黃酮的提取率分別為2.74%、2.81%、2.77%，平均值為2.77%，RSD值為1.27%。結(jié)果表明所選工藝合理、穩(wěn)定、可行。

3 討論

測定黃酮含量目前最常用的方法是紫外-可見光分光光度法（比色法），是被測物質(zhì)在適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色后，在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的測定吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，從而對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法[18]?？傸S酮含量的測定往往采用蘆丁作對照品，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后，在510nm處測定吸光度值[14]。

實驗選擇對總黃酮提取率影響量較大的乙醇濃度、料液比、提取時間以及提取次數(shù)為4個主要因數(shù)，采用正交實驗法優(yōu)化艾納香的總黃酮提取工藝。實驗結(jié)果可知，提取次數(shù)對艾納香中總黃酮的提取影響最大，其次為乙醇濃度、提取時間和料液比。最終優(yōu)選的工藝條件為采用16倍量的50%的乙醇提取3次，每次提取1.5h。該工藝驗證，3次提取結(jié)果的總黃酮提取率RSD值為2.0%，說明該工藝重復(fù)性良好，且總黃酮提取量最大，因此確定為最佳提取條件，為后續(xù)的艾納香研究實驗作為參考。隨著臨床研究的進(jìn)一步發(fā)展，艾納香中總黃酮的藥理作用及作用機(jī)制將進(jìn)一步被闡釋說明，本實驗得出的最佳提取工藝將對彝族“黃藥”艾納香的深度開發(fā)利用提供了可靠的實驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006.

[2]龐玉新，謝小麗，陳振夏，等.艾納香本草考證[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：10-13.

[3]龐玉新.艾納香遺傳多樣性與艾納香屬分子系統(tǒng)學(xué)研究[D].北京： 北京中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[4]楊本雷.中國彝族藥學(xué)[M].昆明：云南民族出版社，2004：156-157.

[5]黃火強(qiáng)，蔣慧嫦，張亞琛，等.彝族“黃藥”（艾納香）二氯甲烷提取物對Lewis肺癌小鼠抑瘤作用的研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)），2016，31（6）：1058-1064.

[6]林永成，龍康侯，鄧一軍. 中藥艾納香化學(xué)成分的研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），1988（2）：77-80.

[7]N Saewan.Anti-tyrosinase and anti- cancer activities of flavonoids from Blumea balsamifera DC[ J]，2011，? 5 （ 6 ） ： 1018 - 1025.

[8]陳銘. 艾納香的活性成分研究[D].上海：上海交通大學(xué)，2009.

[9]謝月英，謝朋飛，黃寶優(yōu)，等.艾納香屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究概況[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18（8）：1071-1076.

[10]嚴(yán)啟新，譚道鵬，康暉，等.艾納香中的黃酮類化學(xué)成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（5）：86-89.

[11]Norikura Toshio，Kojima- Yuasa Akiko，Shimizu Miki，et al.Mechanism of growth inhibitory effect of Blumea balsamifera extract in hepatocellular carcinoma[ J]，2008，? 72 （ 5 ） ： 1183 - 1189.

[12]Hiroo H， Yasuaki Y， Kanki K， et al. Dihydroflavonol BB-1， an extract of natural plant Blumea balsamifera，abrogates TRAIL resistance in leukemia cells[J]. Blood，2006（107）： 679-688.

[13]LF Shyur， JH Tsung， JH Chen， et al. Antioxidant properties of extracts from medicinal plants popularly used in Taiwan[J]. Int J Appl Sci Engin，2005，3（3）：195-202.

[14]黃永林，趙志國，文永新.不同部位艾納香中總黃酮的含量測定[J].廣西植物，2006，26（4）：453-455.

[15]羅夫來，張云淋，趙致.正交設(shè)計優(yōu)化艾納香總黃酮提取工藝研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（12）：2735-2737.

[16]和銀霞，董一昕，冶澤青.艾納香總黃酮提取工藝優(yōu)化及其含量測定方法研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，18（11）35-37.

[17]黃火強(qiáng)，丁福榮，李璞，等.彝族“黃藥”艾納香化學(xué)成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（21）：106-108.

[18]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M] .北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：89.

（收稿日期：2018-11-14 編輯：陶希睿）