綠豆多肽化橘紅復(fù)合解酒飲料的制備及其體外解酒作用

葛馳宇,張君麗,*,董書池

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥工程學(xué)院,江蘇淮安 223003;2.江蘇省蛋白質(zhì)類藥物工程實驗室,江蘇淮安 223003;3.江蘇今世緣釀酒學(xué)院,江蘇淮安 223005)

中國是一個酒文化大國,從古至今,飲酒是各種社會交際活動不可或缺的一部分。大量飲酒給國人的健康帶來了嚴重的傷害,尤其對肝臟的影響最大[1]。目前市場上的解酒產(chǎn)品品種繁多、但口味欠佳、功能性不一[2]。通過對解酒產(chǎn)品市場的調(diào)研,發(fā)現(xiàn)解酒產(chǎn)品以“解酒藥”為主,主要有三個來源:第一類是海洋動物,開發(fā)成本較高,應(yīng)用面有限。第二類是化學(xué)藥物,同時含有興奮劑、維生素等,解酒機理僅僅是促進酒精分解,起到暫時性的緩解作用,很難起到護肝作用,同時濫用會對身體有一定的毒副作用。第三類是中藥,在各種中藥解酒方劑中普遍使用葛根、甘草和陳皮,由于這些解酒中藥材的使用已深入人心,對其解酒功效的挖掘也達極致[2-4]。因此,開發(fā)新的解酒中藥材逐漸成為研究熱點。

生物活性多肽具有綠色健康、易吸收、來源廣、安全性好的特點[5],逐漸受到研究者的青睞,其中綠豆多肽可以激活乙醇脫氫酶(ADH)的活性,加速機體內(nèi)乙醇的代謝,起到較好的解酒作用[6]?；偌t是蕓香科植物油或化州柚未成熟或近成熟的干燥外層果皮,主要含有柚皮苷、野漆樹苷、枳屬苷及新橙皮苷[7],其中的柚皮苷對于急性酒精中毒有著一定的療效,能較快地醒酒并緩解醉酒過程中產(chǎn)生的不適,對防止醉酒和加速醒酒具有良好的效果[8]。但是,目前缺乏將生物活性多肽與中藥聯(lián)合用于解酒領(lǐng)域的報道。

因此,本研究以綠豆多肽和化橘紅為原材料,通過響應(yīng)面實驗獲得感官品質(zhì)較好的綠豆多肽化橘紅復(fù)合解酒飲料(綠橘解酒飲,MECIB),并探討綠橘解酒飲的體外解酒作用,以期為解酒產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆粕粉 淮安飛華農(nóng)場;化橘紅(經(jīng)江蘇益豐大藥房麥艷研究員鑒定,其原植物為化州柚ExocarpiumcitriGrandis) 江蘇益豐大藥房;焦磷酸鈉、乙醇、鹽酸、鄰苯三酚 南京化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶、氧化型輔酶I、乙醇脫氫酶(ADH)、Tris-HCl、食品級檸檬酸、羅漢果甜 南京良瑋生物科技有限公司;RU21解酒藥(10 mg/mL,主要成分為維生素C、琥珀酸、富馬酸、谷氨酸鹽) 美國精神科學(xué)有限公司。

LST-20高速中藥粉碎機 常熟市中藥機械廠;Biosofre1000超聲波破碎儀 賽飛(中國)有限公司;紫外-可見分光光度計、AR224CN電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠;L-550臺式離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;低速搖床 江蘇天翎儀器有限公司;實驗型飲料生產(chǎn)線 上海達程實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠橘解酒飲的制備

1.2.1.1 綠豆多肽的制備 參照文獻[9-10]方法提取綠豆多肽,主要流程如下:

水提取:料液比1∶15 g/mL(每克綠豆粕粉加入15 mL的去離子水),用去離子水維持pH在7.0,提取溫度40 ℃,放入低速搖床,轉(zhuǎn)速40 r/min,100 min后將離心機轉(zhuǎn)速調(diào)至3000 r/min,離心18 min,除去不溶物后將上清液進行酸沉淀。

酸沉淀:上清液pH用1 mol/L鹽酸調(diào)至4.5后放入低速搖床,設(shè)置轉(zhuǎn)速為40 r/min,每隔5 min測定溶液pH,不停攪拌,并保持溶液pH始終在4.5左右,100 min后停止所有操作,靜置30 min后將樣品放入離心機,調(diào)整轉(zhuǎn)速為3000 r/min,離心5 min,收集沉淀,去離子水洗兩次,冷凍干燥,得綠豆蛋白。

酶解:將綠豆蛋白用木瓜蛋白酶水解,酶解條件為:酶解溫度為55 ℃,酶解時間為4 h,料液比1∶15 g/mL,加酶量3000 U/g,酶解pH7.2。按此條件獲得綠豆蛋白的水解產(chǎn)物。

超濾:選用截留分子量為2000和5000 Da的超濾膜,收集2000～5000 Da之間的綠豆多肽,再經(jīng)活性炭處理、離子交換層析、真空濃縮、高壓均質(zhì)、噴霧干燥、過篩等程序,即得到綠豆多肽成品。

1.2.1.2 化橘紅濃縮汁的制備 化橘紅中解酒的主要成分是柚皮苷,依據(jù)文獻[11-12],按下法制備化橘紅濃縮汁:取化橘紅隔水蒸煮,60 ℃烘干、粉碎,過40目篩,備用,即為化橘紅樣品。將該化橘紅樣品按下述條件進行提取:超聲功率158 W,提取液乙醇濃度為40%,料液比1∶42 mL/g,提取溫度為55 ℃,超聲時間48 min。提取結(jié)束后收集提取液,抽濾,再減壓蒸餾完全除去濾液中乙醇,濃縮至柚皮苷含量為1.6%(m/v)的化橘紅濃縮汁。

1.2.1.3 綠橘解酒飲品的制備與口感改善 為了改善口感,采用羅漢果甜和檸檬酸改善飲品酸甜比。將綠豆多肽、化橘紅濃縮汁、羅漢果甜和檸檬酸按一定的比例調(diào)配好,放入均質(zhì)機,均質(zhì)溫度65 ℃,均質(zhì)時間15 min,均質(zhì)壓力15 MPa。均質(zhì)后迅速進入滅菌操作,即加熱至85 ℃,恒溫5 min,快速冷卻至常溫。滅菌后立即灌裝到已滅菌好的潔凈玻璃瓶中,封口備檢,即為綠橘解酒飲成品。

1.2.2 感官品質(zhì)評價 為盡量避免偶然誤差和個體誤差,本研究從不同的人群中隨機選擇人員17名對綠橘解酒飲進行感官評價實驗,其中飲料生產(chǎn)專業(yè)人員9人,非飲料生產(chǎn)專業(yè)人員8人;男性12人,女性5人;20～30歲4人,31～40歲4人,41～50歲5人,51～60歲4人,通過上述17人的平均感官評分的高低來確定綠橘解酒飲的配比。綠橘解酒飲的感官品質(zhì)評價標準參考文獻[13-14],如表1所示。

表1 綠橘解酒飲感官品質(zhì)評價標準Table 1 The beverage sensory evaluation standard of MECIB

1.2.3 綠橘解酒飲的單因素實驗

1.2.3.1 綠豆多肽添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響 固定化橘紅濃縮汁添加量9%,羅漢果甜添加量0.1%,檸檬酸添加量0.18%,考察綠豆多肽添加量為12%、13%、14%、15%、16%時的感官得分,實驗重復(fù)三次。

1.2.3.2 化橘紅濃縮汁添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響 固定綠豆多肽添加量為14%,羅漢果甜添加量為0.1%,檸檬酸添加量為0.18%,考察化橘紅濃縮汁添加量為7%、8%、9%、10%、11%時的感官得分,實驗重復(fù)三次。

1.2.3.3 羅漢果甜添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響 固定綠豆多肽添加量為14%,化橘紅濃縮汁添加量為9%,檸檬酸添加量為0.18%,考察羅漢果甜添加量為 0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%時的感官得分,實驗重復(fù)三次。

1.2.3.4 檸檬酸添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響 固定綠豆多肽添加量為14%,化橘紅濃縮汁添加量為 9%,羅漢果甜添加量為0.1%,考察檸檬酸添加量為 0.14%、0.16%、0.18%、0.20%、0.22%時的感官得分,實驗重復(fù)三次。

1.2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化的響應(yīng)面實驗 通過對單因素實驗結(jié)果分析,以綠豆多肽添加量、化橘紅濃縮汁添加量、羅漢果甜添加量、檸檬酸添加量為自變量,以綠橘解酒飲的感官品質(zhì)評分為考察指標,利用Design-Expert 8.0軟件,設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面實驗,探索綠橘解酒飲的最佳感官品質(zhì)配比,方案如表2所示。實驗重復(fù)三次。

表2 綠橘解酒飲響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平Table 2 Experimental design factor and level of the response surface of MECIB

1.2.5 綠橘解酒飲體外乙醇脫氫酶(ADH)激活率測定 ADH的活力測定常采用瓦勒-霍赫法[15]。主要方法如下:在試管中加入1.5 mL的焦磷酸鈉溶液(pH8.8),再加入1.0 mL的0.027 mol/L的氧化型輔酶I(NAD+),0.5 mL 11.5%的乙醇溶液,綠橘解酒飲0.1 mL,混勻后,置25 ℃水浴保溫5 min,保溫結(jié)束立即向試管中加入0.1 mL ADH(0.25 U/mL),混勻后立即在340 nm波長下用分光光度計測定吸光值A(chǔ)340,之后每隔10 s后記錄一次A340,連續(xù)記錄5 min。以0.5 mL蒸餾水代替11.5%的乙醇溶液做空白對照調(diào)零,以0.1 mL蒸餾水代替綠橘解酒飲為陰性對照,以公認解酒效果最好的等體積的進口藥物RU21為陽性對照。取最初線性部分作圖,以A340為縱坐標,時間為橫坐標,計算每分鐘A340的增加值(ΔA340)值,根據(jù)生成的NADH在340 nm時摩爾消光系數(shù)為6.2,計算ADH的活力單位,ADH的活力以每分鐘生成NADH的納摩爾數(shù)(nmol/min)表示,按公式(1)計算ADH活力,并按公式(2)計算激活率:

ADH活力(U/mL)=ΔA340/10s×(反應(yīng)總體積/酶量)×106/(6.2×103)

式(1)

R(%)=(U1-U0)/U0×100

式(2)

式中：R為ADH激活率(%),U1為綠橘解酒飲樣品的ADH活力,U0為陰性對照組的ADH活力。結(jié)果平行測定三次。

1.2.6 綠橘解酒飲的體外抗氧化效果測定 參照文獻[16],體外測定超氧陰離子的方法為鄰苯三酚法,即在10 mL比色管中加入4.5 mL的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH8.2),1 mL的綠橘解酒飲,2.5 mL的蒸餾水混勻,10 min后加入0.1 mL的鄰苯三酚(6 mmol/L),搖勻后靜置3 min,加入0.1 mL的HCl(10 mmol/L)終止反應(yīng),在325 nm下測定溶液的吸光度,記為A1,以等體積的蒸餾水代替綠橘解酒飲作為空白組進行上述實驗,吸光度記為A0,同樣以等體積的RU21為陽性對照。清除率計算公式如公式(3)所示:

清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 綠豆多肽添加量對綠橘解酒飲感官評分的影響 圖1結(jié)果表明隨著綠豆多肽的添加量增加,感官評分先增加后降低,當(dāng)綠豆多肽添加量為14%時,綠橘解酒飲感官品質(zhì)評價最高。這可能是提取綠豆多肽的過程中產(chǎn)生的豆腥味物質(zhì),其含量少時不影響感官評分,但隨著綠豆多肽含量逐漸增加,豆腥味越來越濃,導(dǎo)致口感逐漸降低。所以綠豆多肽的添加量選擇在13%～15%。

圖1 綠豆多肽添加量對綠橘解酒飲感官評分的影響

2.1.2 化橘紅濃縮汁添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響 圖2結(jié)果表明隨著化橘紅濃縮汁的添加量增加,感官評分也是先增加后降低,當(dāng)化橘紅濃縮汁添加量為9%時,綠橘解酒飲感官品質(zhì)評價最高。這可能是化橘紅隨著含量增加,苦味越來越重,嚴重影響了飲料的口感,故化橘紅濃縮汁的含量選擇在8%～10%之間。

圖2 化橘紅濃縮汁添加量對綠橘解酒飲感官評分的影響

2.1.3 羅漢果甜添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響 圖3結(jié)果表明隨著羅漢果甜的添加量增加,感官評分亦是先增加后降低,當(dāng)羅漢果甜添加量為0.1%時,綠橘解酒飲感官品質(zhì)評分最高。當(dāng)羅漢果甜添加量超過0.1%時,可能綠橘解酒飲甜度過甜,破壞口感。因此羅漢果甜的添加量選擇在0.05%～0.15%。

圖3 羅漢果甜添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響

2.1.4 檸檬酸添加量對綠橘解酒飲感官評分的影響 圖4結(jié)果表明隨著檸檬酸的添加量增加,感官評分亦是先增加后降低,當(dāng)檸檬酸添加量為0.16%時,綠橘解酒飲感官品質(zhì)評價最高。檸檬酸具有明顯的酸味,微澀,可能是隨著檸檬酸添加量的增加,當(dāng)添加量超過0.16%時,綠橘解酒飲的酸味變強,影響口感。因此檸檬酸的添加量選擇在0.14%～0.18%。

圖4 檸檬酸添加量對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素實驗過程中,上述各成分添加量在很窄的范圍內(nèi)對綠橘解酒飲感官品質(zhì)有較大的影響。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以綠豆多肽添加量(A)、化橘紅濃縮汁添加量(B)、羅漢果甜添加量(C)與檸檬酸添加量(D)為變量,使用Design-Expert 8.0軟件,采用Box-Behnken法設(shè)計實驗,方案及感官評分結(jié)果如表3所示。

表3 綠橘解酒飲感官品質(zhì)評價響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Response surface method design and results of the sensory evaluation on MECIB

2.3 綠橘解酒飲感官品質(zhì)評價模型分析

應(yīng)用Design expert 8.0對表3中數(shù)據(jù)進行分析,獲得回歸方程為R=78.96+3.63A+4.97B+1.56C-1.25D+5.32AB+3.37AC-1.95AD-3.98BC-3.87BD+3.93CD-1.63A2+1.68B2+7.02C2+3.64D2,方程的R2值為0.9748,方差分析表明,回歸方程模型極顯著(p<0.0001),且失擬項不顯著(p=0.4032),表明該方程與實際的擬合度較好,可以使用該方程代替真實情況來尋找最佳綠橘解酒飲的配制條件。由表4方差分析模型的顯著性可以發(fā)現(xiàn),任意兩個因素的交互關(guān)系(AB、AC、AD、BC、BD和CD)與各因素的二次項(A2、B2、C2和 D2)對綠橘解酒飲感官品質(zhì)有顯著影響(p<0.05),通過對回歸方程系數(shù)絕對值大小的計算,可以判斷對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響順序為化橘紅濃縮汁添加量(B)>綠豆多肽添加量(A)>羅漢果甜添加量(C)>檸檬酸添加量(D)。

表4 綠橘解酒飲的回歸模型及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation on MECIB

根據(jù)Design expert 8.0中“Optimization”功能,以最佳綠橘解酒飲感官品質(zhì)(評分最高分)為目標,對綠橘解酒飲中各成分添加量進行篩選,結(jié)果顯示最佳感官品質(zhì)的理論評分為94.99分,配方為:為綠豆多肽添加量14.01%(0.01)、化橘紅濃縮汁添加量為9.84%(0.84)、羅漢果甜添加量為0.05%(-1)、檸檬酸添加量為0.156%(-0.2)。按此配方進行驗證試驗,重復(fù)三次,最終獲得感官評分均值為94.64±1.28,經(jīng)回歸方程擬合的理論評分與實際評分相差0.37%,表明用響應(yīng)面法可以較好地設(shè)計綠橘解酒飲的制備工藝。

2.4 交互作用分析

為了便于觀察上述綠豆多肽、化橘紅濃縮汁、羅漢果甜、檸檬酸各自添加量這四個因素及其相互作用同時對綠橘解酒飲感官品質(zhì)的影響,將其他兩個因素保持不變,獲得圖5～圖10所示的六組動態(tài)響應(yīng)面的曲面圖,圖中R為感官評分。分析確定各因素的最佳參數(shù)的范圍。

圖5 綠豆多肽添加量(A)和化橘紅濃縮汁添加量(B)的交互作用結(jié)果圖

圖6 綠豆多肽添加量(A)和羅漢果甜添加量(C)的交互作用結(jié)果圖

圖7 綠豆多肽添加量(A)和檸檬酸添加量(D)的交互作用結(jié)果圖

圖8 化橘紅濃縮汁添加量(B)和羅漢果甜添加量(C)的交互作用結(jié)果圖

圖9 化橘紅濃縮汁添加量(B)和檸檬酸添加量(D)的交互作用結(jié)果圖

圖10 羅漢果甜添加量(C)和檸檬酸添加量(D)的交互作用結(jié)果圖

圖5～圖10的結(jié)果顯示,各圖中曲面均很陡峭,表明任意兩個因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響均很顯著,與表4中方差分析結(jié)果完全吻合。其中圖5所示為固定羅漢果甜添加量與檸檬酸添加量為零水平,綠豆多肽添加量與化橘紅濃縮汁添加量對感官評分的影響和二者之間的交互作用。隨著綠豆多肽的添加量逐漸增加,感官評分呈現(xiàn)平緩下降的趨勢;而隨著化橘紅濃縮汁添加量逐漸增加,感官評分顯著上升,且化橘紅濃縮汁添加量導(dǎo)致感官評分的上升幅度明顯比綠豆多肽添加量導(dǎo)致感官評分的下降的幅度要陡峭,說明化橘紅濃縮汁添加量對感官評分的影響較綠豆多肽添加量大。

圖8所示為固定綠豆多肽添加量與檸檬酸添加量為零水平,羅漢果甜添加量與化橘紅濃縮汁添加量對感官評分的影響和二者之間的交互作用。隨著羅漢果甜的添加量逐漸增加,感官評分呈現(xiàn)平緩下降成平臺的趨勢,而隨著化橘紅濃縮汁添加量逐漸增加,感官評分亦顯著上升,且化橘紅濃縮汁添加量導(dǎo)致感官評分的上升幅度大于羅漢果甜添加量導(dǎo)致感官評分的下降的幅度,說明化橘紅濃縮汁添加量對感官評分的影響較綠豆多肽添加量大。

圖9所示為固定綠豆多肽添加量與羅漢果甜添加量為零水平,檸檬酸添加量與化橘紅濃縮汁添加量對感官評分的影響和二者之間的交互作用。隨著檸檬酸的添加量逐漸增加,感官評分呈現(xiàn)下降趨勢,而隨著化橘紅濃縮汁添加量逐漸增加,感官評分呈上升趨勢,且化橘紅濃縮汁添加量導(dǎo)致感官評分的上升幅度大于檸檬酸添加量導(dǎo)致感官評分的下降的幅度,說明化橘紅濃縮汁添加量對感官評分的影響亦較檸檬酸添加量大。

2.5 綠橘解酒飲體外乙醇脫氫酶激活率測定結(jié)果

圖11表明,綠橘解酒飲對ADH的激活率達到39.42%±0.77%,陽性對照RU21對ADH的激活率達到41.22%±1.66%,綠橘解酒飲與RU-21對ADH的激活率無顯著性差異(p>0.05)。

圖11 綠橘解酒飲和RU21的ADH激活率實驗結(jié)果

2.6 綠橘解酒飲體外抗氧化結(jié)果

如圖12所示,綠橘解酒飲對超氧陰離子的清除率達到90.16%±0.96%,陽性對照RU21對超氧陰離子的清除率達到92.78%±0.76%,綠橘解酒飲與RU-21對超氧陰離子的清無顯著性差異(p>0.05)。

圖12 綠橘解酒飲和RU21的抗氧化實驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面法獲得了綠橘解酒飲的最佳配比為綠豆多肽添加量14.01%、化橘紅濃縮汁添加量為9.84%、羅漢果甜添加量為0.05%、檸檬酸添加量為0.156%。感官品質(zhì)評分均分為94.64±1.28分,與模型預(yù)測結(jié)果(94.99分)相差0.37%,體外考察綠橘解酒飲對ADH的激活率為39%,對超氧陰離子的清除率達90%,與陽性對照RU21相比無顯著性差異,顯示出較好的體外解酒效果。綜上所述,綠橘解酒飲制備工藝簡單、口感佳、具有一定的解酒作用。