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    超高效液相-飛行時間質(zhì)譜法測定郫縣豆瓣中的亞精胺

    2019-06-25 09:36:36茍美玲張靜
    中國調(diào)味品 2019年6期
    關(guān)鍵詞:精胺豆瓣醬郫縣

    茍美玲,張靜

    (成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,成都 611130)

    郫縣豆瓣醬被譽(yù)為“川菜之魂”,以二荊條紅辣椒、青皮蠶豆等為主要材料,通過自然發(fā)酵而成[1]。目前標(biāo)準(zhǔn)中雖然對郫縣豆瓣的理化指標(biāo)提出了規(guī)范要求,但對郫縣豆瓣醬中的亞精胺含量未做相關(guān)規(guī)定。郫縣豆瓣醬中的亞精胺主要來源于原料蠶豆和發(fā)酵微生物的脫羧反應(yīng)[2]。亞精胺具有抗氧化、抗炎、改善線粒體代謝的功能[3]。近年來,亞精胺的抗衰老活性越來越受到人們的關(guān)注[4]。亞精胺的許多抗衰老作用與受損細(xì)胞器的降解和自噬機(jī)制的激活使細(xì)胞質(zhì)材料的回收有關(guān)[5,6]。亞精胺也存在于人體內(nèi),與人類健康息息相關(guān)[7]。適量的亞精胺有益于人體健康,但當(dāng)其在動物和人體內(nèi)積聚達(dá)到高水平或其攝入過量時會變得具有毒性[8],可能引起頭痛、頭暈、惡心、心悸等癥狀[9,10],因此有必要對郫縣豆瓣中亞精胺的含量進(jìn)行有效檢測和控制。

    由于亞精胺結(jié)構(gòu)中沒有生色基團(tuán),既沒有紫外吸收,也沒有熒光及電化學(xué)活性,使得亞精胺的分離和測定都存在一定的困難,目前文獻(xiàn)報道的測定亞精胺的方法主要有氣相色譜法(GC)[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12]、離子色譜法(IC)[13]、薄層色譜法(TLC)[14]、生物傳感器法[15]、毛細(xì)管電泳法(CE)[16]等。

    由于高效液相色譜法具有分離效率高、分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確等特點,國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.208-2008和許多文獻(xiàn)中均使用高效液相色譜法測定食品中的亞精胺含量。但是高效液相色譜法需要將目標(biāo)物進(jìn)行柱前或柱后衍生之后才能進(jìn)行檢測,因此存在衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、操作復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、質(zhì)量控制相對較難等不足,顯然不適合作為郫縣豆瓣醬的大量檢測。因此,本文旨在建立一種簡單、快速的亞精胺檢測方法,適用于大批量郫縣豆瓣醬中亞精胺的監(jiān)控。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    實驗所用10種豆瓣醬均購于成都某超市,命名為YP-1~YP-10。

    亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司;乙腈(色譜級):美國Sigma公司;甲酸(色譜級):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    X500R飛行時間質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源,ESI) 美國AB SCIEX公司;超高效液相色譜系統(tǒng) 日本SHIAMDZU公司;Heto-HSC500真空冷凍干燥機(jī) 上海佰蕾真生物科技有限公司;SB-5200 DNT超聲清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;萬能高速粉碎機(jī) 深圳尼嘉商貿(mào)有限公司;TD-5M離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司;IKA Vortex 2渦旋混勻器 德國IKA公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品制備

    分別稱取50 g樣品于-50 ℃真空冷凍干燥機(jī)中24 h,干燥后用萬能高速粉碎機(jī)粉碎,過80目篩,然后盛裝在潔凈的密封袋中,備用。

    稱取0.5 g樣品粉末于50 mL離心管中,加入20 mL色譜級乙腈,渦旋30 s,于20 ℃超聲提取30 min,4000 r/min離心15 min,取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

    準(zhǔn)確稱取1 mg(精確至0.00001 g)亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品,加入10 mL乙腈溶液,配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 超高效液相色譜條件

    色譜柱:Phenomenex C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);柱溫:30 ℃,流速:0.2 mL/min,進(jìn)樣量:2 μL;流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水溶液;洗脫梯度:0~3 min,20%~50% A;3~5 min,50%~100% A;5~7 min,100% A;7~10 min,100%~20% A;柱溫:30 ℃,流速:0.2 mL/min,進(jìn)樣量:2 μL。

    1.3.4 質(zhì)譜條件

    離子源:電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI),正離子模式;噴霧氣1(gas 1):45 psi,噴霧氣2(gas 2):50 psi;氣簾氣(CUR):35 psi;溫度:500 ℃;離子化電壓:5500 V;去簇電壓(declustering potential,DP):60 V;碰撞能量(collision energy,CE):20 V。全掃使用Q-TOF的IDA,一級質(zhì)量掃描范圍m/z 50~250。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的確定

    2.1.1 母離子選擇

    以20 mg/L的亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液為實驗對象,在正離子掃描模式下進(jìn)行母離子全掃描,掃描范圍m/z 50~250,結(jié)果見圖1。

    由圖1可知,響應(yīng)強(qiáng)度最高的為m/z 146.1644 離子,響應(yīng)強(qiáng)度高達(dá)1.5×106cps,由亞精胺分子式C7H19N3可知該離子為亞精胺的加氫離子,因此選擇m/z146.1644離子為母離子。

    2.1.2 子離子選擇

    以加氫離子m/z 146.1644為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,亞精胺的二級質(zhì)譜圖見圖2,其主要產(chǎn)生5個碎片離子,分別為m/z 129.1386,112.1120,84.0808,72.0806,58.0651。

    由圖2可知,碎片離子m/z 72.0806是響應(yīng)值最高的子離子,因此選擇m/z 146.1649/72.0806為定量離子對,其次為m/z 112.1120,因此選擇m/z 146.1649/112.1120為定性離子對。

    2.1.3 MRM優(yōu)化結(jié)果

    由圖2可知,m/z 146.1649/72.0806為定量離子對,m/z 146.1649/112.1120為定性離子對。因此以子離子m/z 72.0806和m/z 112.1120的響應(yīng)強(qiáng)度為評價指標(biāo),對亞精胺的去簇電壓及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見圖3。

    圖1 亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液母離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Scanning mass spectrometry of precursor ion in spermidine standard solution

    圖2 亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液二級質(zhì)譜圖Fig.2 Scanning mass spectrometry of fragment ions in spermidine standard solution

    圖3 MRM條件優(yōu)化:去簇電壓(A)和碰撞能量(B)Fig.3 MRM condition optimization: declustering potential (A) and collision energy (B)

    由圖3A可知,碎片離子m/z 72.0806和m/z 112.1120在去簇電壓為65 V時達(dá)到最大響應(yīng)值。當(dāng)去簇電壓超過65 V時,二者的響應(yīng)值均有不同程度的下降,因此選擇65 V為最佳的去簇電壓。由圖3B可知,碎片離子m/z 72.0806和m/z 112.1120的響應(yīng)強(qiáng)度隨碰撞能量的增加而增加,當(dāng)碰撞能量達(dá)到25 V時獲得了最大響應(yīng)值,因此選擇25 V為最佳碰撞能量。

    2.2 方法學(xué)研究

    在本研究中,通過測定加標(biāo)回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限、精密度來驗證方法的準(zhǔn)確性。

    2.2.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

    將亞精胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋成5個濃度:10.0,4.0,2.0,1.0,0.5 mg/L。按優(yōu)化好的實驗條件進(jìn)行分析,以亞精胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)R2。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以標(biāo)準(zhǔn)溶液3∶1和10∶1進(jìn)行計算,結(jié)果見表1。

    表1 方法的線性參數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限及定量限Table 1 Linear parameters, matrix effect, detection limits and quantification limits of the method

    由表1可知,亞精胺在0.5~10 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)R2>0.999,檢出限為0.031 mg/kg,定量限為0.121 mg/kg。

    2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)

    在使用UPLC-MS/MS測定樣品中亞精胺含量時,由于基質(zhì)中不易揮發(fā)的共洗脫成分在噴霧液滴轉(zhuǎn)移到氣態(tài)離子的過程中會與目標(biāo)分析物產(chǎn)生競爭關(guān)系,使得目標(biāo)分析物的質(zhì)譜信號增強(qiáng)或者減弱,從而影響實驗方法的精密度、準(zhǔn)確度[17,18]。盡管串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度和高選擇性,也依然不能從根本上消除基質(zhì)效應(yīng)[19],因此對基質(zhì)效應(yīng)的研究具有重要意義。

    基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液是用樣品提取液溶解標(biāo)準(zhǔn)品,然后用樣品溶液對其進(jìn)行連續(xù)稀釋。本研究隨機(jī)采用YP-1和YP-2作為基質(zhì)效應(yīng)測定的2種基質(zhì),分別用YP-1和YP-2溶解稀釋亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品,最終亞精胺濃度范圍為0.55~6.25 mg/mL。

    由表1可知,亞精胺在YP-1和YP-2的基質(zhì)效應(yīng)分別為-17.72%和-17.42%,2個樣品的基質(zhì)效應(yīng)較為接近,其絕對值均小于20%,因此可以認(rèn)為其幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)??梢哉J(rèn)為,郫縣豆瓣醬中的基質(zhì)對亞精胺含量檢測的影響不顯著,因此可以直接采用標(biāo)準(zhǔn)曲線對亞精胺進(jìn)行定量分析。

    2.2.3 精密度與回收率

    在上述優(yōu)化好的條件下,在樣品中添加高、中、低單個濃度的亞精胺,每個濃度平行測定6次,測定其加標(biāo)回收率和精密度。精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。本實驗選擇YP-1和YP-2測定其加標(biāo)回收率和精密度,結(jié)果見表2。

    表2 方法的加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果(n=6)Table 2 The detection results of recovery rates and precision of the method (n=6)

    由表2可知,亞精胺的平均回收率在92.65%~100.58%范圍內(nèi),RSD在2.01%~6.98%范圍內(nèi),表明此UHPLC-Q-TOF方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好,可用于快速檢測樣品中亞精胺的含量。

    2.3 樣品的測定

    由于紅油豆瓣醬中具有較為完整的蠶豆瓣子以及較大塊的辣椒皮,因此首先對樣品進(jìn)行勻漿均質(zhì)處理,使其呈現(xiàn)較為均勻的醬體形態(tài)。采用上述建立的UHPLC-Q-TOF方法對10種市售品牌紅油豆瓣醬中的亞精胺含量進(jìn)行測定,結(jié)果見表3。

    表3 10種郫縣紅油豆瓣醬樣品中亞精胺的含量Table 3 The content of spermidine of 10 kinds of Pixian bean paste mg/kg

    續(xù) 表

    注:同列肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    由表3可知,亞精胺含量范圍為12.1~29.2 mg/kg,不同品牌紅油豆瓣醬中的亞精胺含量均有顯著性差異(p<0.05),亞精胺含量最高的樣品(YP-2)是含量最低的樣品(YP-6)的2.4倍。豆瓣醬中亞精胺含量主要來源于原料蠶豆和發(fā)酵微生物的作用,各品牌廠家的原料來源、配比和制作工藝等因素都會影響亞精胺的含量,因此今后有必要對郫縣豆瓣醬中的亞精胺含量建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

    3 結(jié)論

    本實驗建立了利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)快速測定郫縣豆瓣醬中亞精胺含量的方法。實驗以乙腈為提取溶劑,在正離子掃描模式下,采用65 V為最佳的去簇電壓,25 V為最佳的碰撞能量對10種市售品牌郫縣紅油豆瓣醬中的亞精胺含量進(jìn)行了測定,并對方法進(jìn)行了系統(tǒng)校驗。實驗結(jié)果表明,亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(R2>0.999),加標(biāo)回收率在92.65%~100.58%之間,實驗重復(fù)性和儀器精密度較好。

    綜上所述,本實驗建立的UHPLC-Q-TOF方法簡單可行,可在短時間內(nèi)對郫縣豆瓣醬中的亞精胺進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。

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