麻楝果實化學(xué)成分及其抗煙草青枯病菌活性的研究

劉 慧，劉壽柏，王 昊，陳惠琴，王 佩，梅文莉，楊克軍，戴好富*

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163000；2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101；3海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228

麻楝(ChukrasiatabularisA.Juss.)屬于楝科(Meliaceae)桃花心木亞科(Subfam.Swietenioideae)麻楝屬(Chukrasia)。該屬僅包括麻楝原種和其變種毛麻楝(Chukrasiatabularisvar.velutina)[1]。麻楝主要分布于亞洲熱帶地區(qū)，在我國海南、廣東、廣西、云南等地均有分布，別名為陰麻樹、白皮香椿。據(jù)文獻(xiàn)報道，三萜類化合物是楝科植物的主要化學(xué)成分[2]。迄今，國內(nèi)外對麻楝化學(xué)成分及生物活性方面的研究集中于根、莖、葉上[3，4]，對果實部分的研究報道較少。麻楝中的化學(xué)成分主要為檸檬苦素型三萜[3]，除此之外，還含有甘遂烷型三萜、酚類和香豆素等類型化合物[4]。本次試驗對麻楝果實乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，旨在篩選出麻楝果實中的生物活性成分，為麻楝的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA N-1300(上海愛朗儀器有限公司)；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；半制備高效液相色譜儀SUMMIT P680A(美國Dionex公司)；質(zhì)譜儀VG Autospec-3000(英國VG公司)；核磁共振儀Bruker AV-500(瑞士Bruker公司，TMS內(nèi)標(biāo))；實驗室純水系統(tǒng) Spring-R10(廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司)。

薄層層析硅膠板、柱色譜硅膠(200～300目)(青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司)；反相材料RP-18(日本Fuji Silysia公司)。

麻楝果實于2014年7月采自海南省?？谑校芍袊鵁釒мr(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍博士鑒定為麻楝屬植物麻楝(ChukrasiatabularisA.Juss.)的果實，憑證標(biāo)本(No.20140726)現(xiàn)存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

將麻楝果實(16.0 kg)曬干后粉碎，室溫下用95%乙醇浸提3次，每次7天。所得浸提液過濾后經(jīng)減壓濃縮得乙醇粗浸膏，隨后將其分散于水中成懸濁液，再依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，分別經(jīng)減壓濃縮得到乙酸乙酯相3 390.0 g、正丁醇相208.0 g。

乙酸乙酯相(3 390.0 g)采用正相硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(20:1～0:1)梯度洗脫，分段收集得到15個流份(Fr.1～Fr.15)。Fr.5(6.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)分離得到4個流份Fr.5-1～ Fr.5-4。Fr.5-4經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物4(3.2 mg)和5(10.3 mg)。Fr.6(21.0 g)經(jīng)重結(jié)晶得到化合物15(18.0 mg)；剩余樣品采用RP-18反相柱色譜，以甲醇-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，分段收集得到20個流份(Fr.6-1～ Fr.6-20)。Fr.6-13(516.8 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)分離得到3個流份Fr.6-13-1～ Fr.6-13-3。Fr.6-13-3經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物9(14.5 mg)、12(23.0 mg)和14(15.6 mg)。Fr.6-14(992.1 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到2個流份Fr.6-14-1和 Fr.6-14-2。Fr.6-14-1經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物7(2.7 mg)和13(6.3 mg)。Fr.6-15(321.4 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到3個流份Fr.6-15-1～ Fr.6-15-3。Fr.6-15-2經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離純化得到化合物6(7.3 mg)、8(13.4 mg)、10(4.6 mg)和11(3.7 mg)。Fr.13(32.0 g)經(jīng)重結(jié)晶及半制備型高效液相色譜儀(C18柱；45%甲醇酸水，流速4 mL/min)分離得到化合物1(43.1 mg)、2(4.0 mg)和3(15.8 mg)。

2.2 抗煙草青枯病菌活性測試

采用濾紙片瓊脂擴散法[5]測定樣品的抗煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)活性。用棉簽將煙草青枯病菌菌株均勻涂布后，選用直徑為6 mm的滅菌濾紙片，在其上加入10 μL的樣品溶液，待有機溶劑揮干后置于含菌平板上，每個平板放置5個濾紙片。28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h后觀察測試結(jié)果，用游標(biāo)卡尺測量并記錄各抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色固體(CH3OH);ESI-MS:m/z183.2 [M-H]-;分子式為C8H8O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6),3.76 (3H,s,7-OCH3);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.3 (C-1),110.0 (C-2,C-6),146.4 (C-3,C-5),139.7 (C-4),169.0 (C-7),52.3 (7-OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報道基本一致，故該化合物鑒定為沒食子酸甲酯 。

化合物2白色固體(CH3OH);ESI-MS:m/z197.2 [M-H]-;分子式為C9H10O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6),4.23 (2H,q,J=7.1 Hz,7-OCH2CH3),1.30 (3H,t,J=7.1 Hz,7-OCH2CH3);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.7 (C-1),109.9 (C-2,C-6),146.5 (C-3,C-5),139.7 (C-4),168.5 (C-7),61.7 (7-OCH2CH3),14.6 (7-OCH2CH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報道基本一致，故該化合物鑒定為沒食子酸乙酯。

化合物3白色晶體(CH3OH);ESI-MS:m/z169.2 [M-H]-;分子式為C7H6O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.9 (C-1),110.3 (C-2,C-6),146.3 (C-3,C-5),139.6 (C-4),170.4 (C-7)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報道基本一致，故該化合物鑒定為沒食子酸。

化合物15白色無定形粉末(CHCl3);ESI-MS:m/z723.5 [M + Na]+;分子式為C37H48O13;1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:7.52 (1H,s,H-21),7.41 (1H,t,J=1.6 Hz,H-23),6.45 (1H,br d,J=1.1 Hz,H-22),5.90 (1H,s,H-30),5.53 (1H,s,H-17),4.65 (1H,s,H-3),3.69 (3H,s,7-OCH3),3.23 (1H,dd,J=1.0,20.0 Hz,H-15a),2.95 (1H,dd,J=9.2,2.6 Hz,H-5),2.81 (1H,m,H-2″),2.69 (1H,dd,J=10.6,20.0 Hz,H-15b),2.55 (1H,m,H-2′),2.45 (1H,dd,J=15.9,9.3 Hz,H-6a),2.26 (1H,dd,J=15.9,2.7 Hz,H-6b),2.05 (2H,m,overlapped,H-11a,H-14),1.88 (1H,d,J=10.8 Hz,H-29a),1.73 (1H,d,J=10.8 Hz,H-29b),1.66 (3H,s,H-32),1.62 (2H,m,overlapped,H-11b,H-12a),1.28 (1H,m,H-12b),1.22 (3H,d,J=7.2 Hz,H-4′),1.18 (3H,d,J=7.2 Hz,H-4″),1.16 (3H,d,J=6.8 Hz,H-3″),1.13 (3H,s,H-19),1.07 (3H,d,J=6.8 Hz,H-3′),1.04 (3H,s,H-18),0.90 (3H,s,H-28);13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:87.3 (C-1),79.9 (C-2),83.2 (C-3),45.5 (C-4),36.9 (C-5),33.8 (C-6),173.0 (C-7),86.5 (C-8),85.7 (C-9),45.4 (C-10),25.4 (C-11),29.2 (C-12),34.6 (C-13),42.9 (C-14),26.7 (C-15),170.5 (C-16),78.6 (C-17),19.8 (C-18),16.4 (C-19),121.3 (C-20),140.8 (C-21),109.8 (C-22),143.0 (C-23),14.6 (C-28),39.6 (C-29),70.7 (C-30),119.1 (C-31),21.3 (C-32),52.2 (7-OCH3),3-isobutyryloxyl [ 176.8 (C-1′),34.7 (C-2′),18.1 (C-3′),19.7 (C-4′)],30-isobutyryloxyl [ 175.1 (C-1′′),34.6 (C-2′′),18.4 (C-3′′),19.5 (C-4′′)]。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故該化合物鑒定為phragmalin 3,30-di-isobutyrate。

3.2 活性分析

采用濾紙片瓊脂擴散法測定麻楝乙酸乙酯萃取物及單體化合物1～15的抗煙草青枯病菌活性。結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物在10 mg/mL濃度下對煙草青枯病菌具有中等拮抗活性(抑菌圈直徑為14.76 mm)，化合物1、2和3具有一定的拮抗活性，化合物4～15均無明顯拮抗活性，活性結(jié)果如表1所示。

表1化合物1～15(1mg/mL)對煙草青枯病菌的拮抗活性

Table 1 Inhibitory activity of compounds1-15(1 mg/mL) againstRalstoniasolanacearum

注:卡那霉素為陽性對照(1 mg/mL)。

Note:Kanamycin as positive control (1 mg/mL).

4 討論

本文采用多種柱色譜技術(shù)，從麻楝果實乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分離鑒定了15個單體化合物，分別鑒定為：沒食子酸甲酯(1)、沒食子酸乙酯(2)、沒食子酸(3)、ozoroalide(4)、stigmast-4-en-6β-ol-3-one(5)、黃柏呈(6)、chukranin A(7)、chisopanin M(8)、21α,24α-methylmelianodiol(9)、toonaciliatin K(10)、21α,25-dimethylmelianodiol(11)、odoratone(12)、bourjotinolone A(13)、hispidone(14)和phragmalin di-isobutyrate(15)，包括9個甘遂烷型三萜，1個檸檬苦素型三萜，1個甾體和4個酚性化合物，其中化合物4～14為首次從麻楝屬植物中分離得到。麻楝植物根、莖、葉部分的化學(xué)成分研究報道多為檸檬苦素型三萜[3，4]，而本次研究發(fā)現(xiàn)麻楝果實中含有較多的甘遂烷型三萜和酚性化合物。本研究結(jié)果豐富了麻楝中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)多樣性，并且首次對該屬植物中分離得到的單體化合物進(jìn)行了抗煙草青枯病菌活性的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1、2和3具有中等的煙草青枯病菌拮抗活性，這為麻楝的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。