甘肅地區(qū)沙棘葉中黃酮類物質含量測定

孫國政/錢 敏/周 蕓 慶陽市食品檢驗檢測中心 甘肅 慶陽 745000

欒海波 甘肅高原圣果沙棘開發(fā)有限公司 蘭州 73000

馮玉升 甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司 蘭州 73000

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）為胡頹子科落葉灌木或小喬木，其干燥成熟的果實為藏族、蒙古族的習用藥材，具有止咳化痰、消食化滯、活血散瘀的功效[1]。除沙棘果之外，沙棘的各個部位均含有多種活性物質，而沙棘葉中的黃酮類物質含量尤其高，具有很高的經(jīng)濟價值，近年來陸續(xù)開發(fā)出一些功能性食品，進入了大眾的生活[2]。沙棘葉中黃酮類物質具有抗心肌缺血、抗心律失常、提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗?jié)?、抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗衰老等廣泛的藥理作用[3]。

沙棘作為西部防風治沙的主要經(jīng)濟作物，在甘肅野生和種植都很廣泛，沙棘葉原料豐富，市場前景廣闊。深入開發(fā)沙棘葉的經(jīng)濟價值，尤其是其醫(yī)藥方面的利用價值，則需要有簡便、快捷、全面的檢測分析方法，以便對沙棘葉的活性成分進行更為精準有效的分析。本研究以甘肅地區(qū)沙棘葉為研究對象，對不同產(chǎn)地和不同生長時期沙棘葉中黃酮類物質進行測定分析，為沙棘葉資源評價和開發(fā)提供科學數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；UV8100D型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科）；千分之一/萬分之一天平（德國賽多利斯）。

1.2 材料與試劑

沙棘葉采集自甘肅慶陽（編號：Q）、張掖（編號：Z）、定西（編號：D）、平?jīng)觯ň幪枺篜）。

標準物質：蘆?。ㄅ枺篞4160050，純度：99.3%， 上 海 安 普 ）； 槲 皮 素（ 批號：100081-201610，純度： 99.1%，中國食品藥品檢定研究院）；山柰酚（批號：S1330010，純度：99.1%， 上 海 安 普 ）； 楊 梅 素（ 批號：R7580010，純度：99.8%，上海安普）；異鼠李素（批號：K4000025，純度：99.4%，上海安普）。

其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品預處理

將采集的沙棘葉除雜，自然干燥后粉碎，過20目篩，分類編號，干燥減重法測定水分，密封裝袋，0～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總黃酮含量測定

以蘆丁為對照品，紫外可見分光光度計法，在500nm的波長處測定沙棘葉中總黃酮含量[1]。

2.2.1 對照品溶液的制備

準確稱取經(jīng)減壓干燥的蘆丁標準品20mg，置于50mL容量瓶中，加65%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取25mL，置50mL容量瓶中，加65%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含蘆丁0.2mg）。

2.2.2 標準曲線的制備

準確吸取0.2mg/mL的蘆丁對照品溶液0，1，2，4，6，8，10mL于 25mL比色管中，各加入65%乙醇至12.5mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻放置5min，再加入10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻后放置 5min，再加入 1.0mol/L氫氧化鈉溶液5mL，用65%乙醇溶液定容至刻度，以相應試劑做空白，放置15min后，在最大吸收波長500nm處測定吸光度A，以吸光度A為縱坐標，蘆丁質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖1，直線回歸方程為：Y=0.6003A+0.0202（R2=0.9994）。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取粉碎的沙棘葉2g，加入70%乙醇30mL，超聲提取15min，65℃水浴回流提取1h，放冷，過濾；殘渣再加入70%乙醇30mL，65℃水浴回流提取1h，放冷，過濾，合并濾液，置100mL容量瓶容中，殘渣用70%乙醇洗滌，洗液并入同一容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，待測定。

2.2.4 樣品測定

精密取供試品溶液10mL于25ml比色管中，加入 65% 乙醇至 12.5mL，照標準曲線制備（2.2.2項）方法，自“加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL”起，以相應試劑為空白對照，依法測定吸光值。按上述直線回歸方程計算供試品溶液的濃度，利用公式：總黃酮的含量（ω%）=提取的總黃酮質量/沙棘葉粉質量×100%=CV/M×100%，即可求得各樣品總黃酮的含量。結果見表1。

表1沙棘葉中總黃酮含量（單位：mg/g，干重計）Table 1 The total content of flavonoids in seabuckthorn leaves(Unit: mg/g， dry weight )

2. 3黃酮類物質的測定

2.3.1 對照品溶液制備

分別精密稱取山柰素、楊梅素、槲皮素、異鼠李素各10.0mg置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，得到4種質量濃度為1000μg/mL的黃酮對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備

精密稱取粉碎的沙棘葉2g，加入70%乙醇20mL，加入25%HCL溶液20mL，超聲提取15min，65℃水浴回流提取1h，放冷，過濾，濾液置于100mL容量瓶容中，殘渣用70%乙醇洗滌，洗液并入同一容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾即得。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（150mm×4.6mm，5.0μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30:70）；流速：1.0mL/min；二級陳列檢測器（370nm）；柱溫：40℃；進樣量：10μL?；旌蠈φ掌泛驮嚇訄D譜見圖2。

圖2 沙棘黃酮類標準品（A）和供試品（B）的色譜圖FIG. 2 The Chromatogram of Flavonoids standard (A)and test (B) of seabuckthorn

2.3.4 樣品測定

將制備的供試品溶液（2.3.2項）注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算各樣品中山奈素、楊梅素、槲皮素、異鼠李素的含量，不同產(chǎn)地和不同生長時期沙棘葉中黃酮含量見表2。

表2沙棘葉中黃酮類物質含量（單位：mg/g，干重計）Table 2 The content of flavonoids in seabuckthorn leaves(Unit: mg/g， dry weight )

對甘肅不同產(chǎn)地和不同生長時期沙棘葉中的黃酮類含量測定結果表明：由圖3可以看出，各地區(qū)不同采摘月份的沙棘葉中總黃酮含量變化不明顯，基本保持在一致水平。沙棘葉中總黃酮含量平均值均為35mg/g，比山西沙棘葉中總黃酮含量測定結果高出12mg [5]，他們測定的結果平均值為23mg/g。

圖3 甘肅不同地區(qū)不同月份沙棘葉中總黃酮含量比較FIG. 3 The Comparison of total flavonoids in seabuckthorn leaves from different regions and growing periods in Gansu

圖4 甘肅不同地區(qū)不同月份沙棘葉中黃酮類物質含量比較（注：Q、P、D、Z分別代表慶陽、平?jīng)?、定西、張掖，?shù)字6、8分別代表采摘時間為6月份和8月份）FIG. 3 The Comparison of flavonoids in seabuckthorn leaves from different regions and growing periods in Gansu

由表2可知：沙棘葉中山奈素、槲皮素、異鼠李素、楊梅素平均含量分別為0.091 mg/g、0.16 mg/g、0.39 mg/g、0.62 mg/g，且各地區(qū)不同采摘時間沙棘葉中上述4種活性物質含量變化不明顯；但從測定結果比較（見圖4）發(fā)現(xiàn)甘肅沙棘葉中楊梅素和異鼠李素含量明顯高于其他2種物質的含量高，分別是 0.62mg/g 和 0.39mg/g，研究[4][5]表明，楊梅素具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、保肝等多種藥理活性，而異鼠李素具有降血糖和血脂活性的藥理作用。

3討論

沙棘防風固沙、保持水土和改良土壤等生態(tài)效益及其果實、果油和果籽含有多種生物活性成分的經(jīng)濟價值已經(jīng)得到大眾的認可。近年研究發(fā)現(xiàn)，沙棘葉也含有維生素類、黃酮類、多酚類、甾醇類、多糖類有機酸等活性成分，其中黃酮類化合物含量比果實中高112.55%[6]。因此，在研究開發(fā)利用沙棘果實、果油和果籽的同時，不能忽略沙棘葉的利用研究，沙棘葉不同于沙棘果，其不受生長環(huán)境氣候惡變而產(chǎn)量減少，資源量比沙棘果更大且易于采摘。甘肅省是沙棘資源大省，自1999年“三北”地區(qū)沙棘工作會議后，針對沙棘耐干旱、耐瘠薄，并具有防風固沙、保持水土、改良土壤等作用，把沙棘資源建設與水土保持生態(tài)環(huán)境建設精密結合起來，擴大沙棘栽植面積，目前野生沙棘加人工栽植的沙棘面積已達450萬畝，主要分布在定西、慶陽、甘南、張掖、臨夏、隴南、平?jīng)?、天水等地，豐富的沙棘資源為研究開發(fā)利用沙棘葉提供了便利。從本研究的測定結果來看，甘肅沙棘葉中含有豐富的楊梅素、異鼠李素等活性物質，所以有必要對沙棘葉進行深層面的研究，以更科學合理利用沙棘資源。

本研究是結合當?shù)厣臣a(chǎn)業(yè)企業(yè)對沙棘葉的基礎研究，在對沙棘葉中有效活性成分測定的同時，也對企業(yè)沙棘產(chǎn)品生產(chǎn)工藝改進、產(chǎn)品質量把關均具有積極作用。由于甘肅自然氣候的限制和接到本項目時間遲的緣故，在本研究中測定項目數(shù)量還不夠多，檢測的項目也不夠全面，在后續(xù)的研究中，我們將加強樣本的采集量，拓寬對沙棘葉的研究內(nèi)容，在深入測定分析沙棘葉中有效活性物質的同時，還將加大對有效活性物質提取純化和沙棘葉保健食品的研究，全面開發(fā)利用沙棘。

本研究重在沙棘葉中有效成分測定，分析比對甘肅不同產(chǎn)地和不同生長時期沙棘葉中有效成分的差異，對黃酮類物質的提取、純化工藝及檢測方法的確認少有研究，而且對此方面的研究已有很多文獻，故在本文中沙棘葉中黃酮類物質的提取、純化工藝及檢測方法均參考文獻。