野葛特異性PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用研究

張麗，劉良科，鄭麗平，劉秤利，劉虹，覃瑞*

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074；2 懷化學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，懷化 418008)

野葛(學(xué)名：Puerarialobata，英文名稱：kudzu)，是隸屬于豆科葛屬的多年生落葉藤本植物. 《本草綱目》記載：野葛，氣味甘、平，無(wú)毒. 中國(guó)葛屬植物中野葛(Puerarialobata)和粉葛(Puerariathomsonii)分布最廣、產(chǎn)量最高[1]. 對(duì)我國(guó)葛屬植物的研究結(jié)果表明，野葛的葛根素及總黃酮含量明顯高于同屬其他植物，粉葛次之，干燥野葛中總黃酮含量高達(dá)5%～10%，干燥粉葛中總黃酮含量也達(dá)到0.5%～4%[2]. 野葛的根莖葉及種子等部位都具有相當(dāng)大的藥用和食用價(jià)值，因此被廣泛用于保健食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，是開(kāi)發(fā)前景廣闊的藥食兩用植物[3].

葛屬植物大多具塊根，野葛和粉葛是商品“葛根”的主要來(lái)源. 葛根的食用價(jià)值主要是從根中提取優(yōu)質(zhì)淀粉----葛粉，葛粉不僅富含人體必需的各種氨基酸和鈣、鐵、鋅、硒等微量元素，還含有一定量的黃酮類物質(zhì)，具有清熱解毒、生津止渴等功效[4]. 由于葛屬植物的塊狀根外形相似，從外觀上難以鑒別. 葛根在加工成粉末后更加容易混淆，市場(chǎng)中的不法商販經(jīng)常在純葛粉里大量地?fù)诫s諸如紅薯粉、馬鈴薯粉等廉價(jià)的薯類淀粉，甚至直接用廉價(jià)淀粉冒充，損害消費(fèi)者利益[5].

目前，在葛根和葛根制品的鑒定方面，主要是以化學(xué)成分測(cè)定為主的儀器分析方法[6-8]. 在分子標(biāo)記方面，也有利用RAPD標(biāo)記[9]對(duì)葛根的遺傳多樣性進(jìn)行分析，但是目前尚未有利用這些標(biāo)記將野葛與其他植物進(jìn)行區(qū)分的報(bào)道.

物種特有的DNA序列可以開(kāi)發(fā)成能夠識(shí)別該物種及其加工產(chǎn)品的標(biāo)記. 該方法與其他檢測(cè)方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果判定簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，非常適合生物真實(shí)身份的判定. 該方法在花生、芝麻等容易導(dǎo)致過(guò)敏的成分檢測(cè)[10]，牛、羊等動(dòng)物源成分的鑒定[11]，以及中藥材的鑒定[12]方面均有廣泛的應(yīng)用. 本研究旨在尋找一段野葛特異性的DNA序列，并以此序列為基礎(chǔ)建立野葛特異性PCR檢測(cè)方法，用于野葛及其制品的檢測(cè)和鑒定.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野外收集湖南、云南、貴州、福建、重慶、安徽、河南等地的14個(gè)不同野葛居群樣品. 其他20種不同種屬的材料由本實(shí)驗(yàn)室收集，材料詳細(xì)信息如表1和表2所示.

表1 14個(gè)不同野葛居群來(lái)源信息Tab.1 Origin of 14 different kudzu populations in this study

表2 特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所用到材料的詳細(xì)信息Tab.2 Detailed information about the materials used in species specificity analysis

PCR試劑、Takara Taq酶皆購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，PCR引物由武漢擎科生物科技有限公司合成.

1.2 植物基因組DNA的提取與檢測(cè)

植物基因組DNA采用QIANGEN公司(德國(guó))生產(chǎn)的DNA小量提取試劑盒提取. DNA濃度和純度檢測(cè)用紫外分光光度法測(cè)定OD260/280. 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和YeaRed核酸染料染色檢測(cè)DNA樣品的完整性. 使用植物18s rDNA基因引物對(duì)所有提取的植物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證基因組DNA的可擴(kuò)增性[13].

1.3 目的基因的獲取

首先對(duì)GenBank中野葛(Puerarialobata)基因信息進(jìn)行檢索分析，在檢索分析時(shí)排除EST或微衛(wèi)星序列，因?yàn)槠湫蛄写蠖嗪芏?，較難設(shè)計(jì)特異性引物. 優(yōu)先選擇具有完整信息的DNA或者cDNA序列，同時(shí)結(jié)合本研究團(tuán)隊(duì)從野葛中克隆獲得的基因序列，對(duì)候選基因序列進(jìn)行Blastn分析，篩選出特異性強(qiáng)、同源序列少的基因序列. 以這些基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)PCR引物，對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行再次Blastn分析，以保證擴(kuò)增片段的特異性. 最后通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出擴(kuò)增條帶單一，擴(kuò)增特異性、穩(wěn)定性均較好的引物組合.

1.4 PCR擴(kuò)增和檢測(cè)

PCR引物利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì). PCR的引物序列如表3所示. PCR反應(yīng)體系為：20 ng/μL DNA 模板 1 μL，10 ×PCR 緩沖液 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 正、反向引物各 0.25 μL，DNA 聚合酶0.5 U，ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL. PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè). PCR產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.

表3 檢測(cè)所用的引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab.3 Primers used in qualitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 候選DNA序列的篩選

通過(guò)序列的收集、篩選和Blastn比對(duì)分析，篩選到野葛查耳酮合成酶基因(D63855)，異戊二烯合酶基因(AY316691)，葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因(KC473599)等基因具有特異性較強(qiáng)的區(qū)域. 以特異性較強(qiáng)的區(qū)域?yàn)閿U(kuò)增靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選擴(kuò)增條帶單一，擴(kuò)增特異性、穩(wěn)定性好的引物組合. 最終篩選出一對(duì)以野葛查耳酮合成酶基因(D63855)上的區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)的引物組合. 圖1為野葛查耳酮合成酶基因(D63855)在NCBI中進(jìn)行Blastn比對(duì)分析的結(jié)果，圖2為篩選出來(lái)的引物組合PlCHSF/PlCHSR的擴(kuò)增序列在NCBI中進(jìn)行Blastn比對(duì)分析的結(jié)果，可以看到該擴(kuò)增序列具有較強(qiáng)的物種特異性.

2.2 物種特異性鑒定

2.2.1 種外擴(kuò)增特異性

選取8種豆科植物、2種模式植物、10種其他植物對(duì)PlCHSF/PlCHSR引物組合的種外特異性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表2). 首先利用引物組合18s rDNA F/18s rDNA R對(duì)20個(gè)其他物種的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析. 結(jié)果提取的20種植物的基因組DNA均能擴(kuò)增出137 bp片段(圖3)，表明提取的20種植物基因組DNA的濃度和純度滿足PCR擴(kuò)增要求. 再利用引物組合PlCHSF/PlCHSR 對(duì)20個(gè)其他物種(表2)的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均無(wú)擴(kuò)增(圖4)，表明PlCHSF/PlCHSR引物組合在其他物種中具有較強(qiáng)的特異性.

圖1 野葛查耳酮合成酶基因的特異性分析Fig.1 Homologous analysis of chalcone synthase gene

2.2.2 種內(nèi)擴(kuò)增穩(wěn)定性

利用引物組合PlCHSF/PlCHSR對(duì)采自我國(guó)14個(gè)不同地區(qū)的野葛的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果14種野葛的基因組DNA均能擴(kuò)增出226 bp的片段(圖5). 對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行序列測(cè)定，DNA序列與理論上一致. 表明引物組合PlCHSF/PlCHSR的擴(kuò)增序列在不同野葛居群中一致性、穩(wěn)定性好，可以作為野葛特異性序列，用于PCR檢測(cè)野葛成分.

圖2 查耳酮合成酶基因PCR擴(kuò)增片段的特異性分析Fig.2 Homologous analysis of PCR amplification fragment for chalcone synthase gene

注：泳道M為DL2000 DNA ladder；泳道1為空白對(duì)照；泳道2～21分別為粉葛、峨眉葛、大豆、長(zhǎng)豇豆、豌豆、蠶豆、綠豆、花生、擬南芥、煙草、水稻、玉米、薏米、蘿卜、大麥、小麥、馬鈴薯、番茄、油菜、棉花圖3 18S rDNA引物對(duì)20種植物基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of 18S rDNAs with DNA from 20 different plant species

注：泳道M為 DL2000 DNA ladder；泳道1為空白對(duì)照；泳道2為野葛葉片基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照；泳道3～22分別為粉葛、峨眉葛、大豆、長(zhǎng)豇豆、豌豆、蠶豆、綠豆、花生、擬南芥、煙草、水稻、玉米、薏米、蘿卜、大麥、小麥、馬鈴薯、番茄、油菜、棉花圖4 PlCHS F/PlCHS R引物對(duì)20種其他植物基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification of PlCHS F/PlCHS R with DNA from 20 different plant species

注：泳道M為 DL2000 DNA ladder；泳道1為空白對(duì)照；泳道2～15的野葛分別來(lái)自湖南、云南、貴州、福建、重慶、安徽、河南等地圖5 PlCHS F/PlCHS R引物對(duì)14種不同野葛基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification of PlCHS F/PlCHS R with DNA from 14 different kudzu populations

2.3 PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了確定引物組合PlCHSF/PlCHSR PCR反應(yīng)的靈敏度，將野葛基因組DNA依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，濃度梯度分別為20，2.0，0.2，0.02，0.002 ng/μL，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示.在模板量為0.02 ng時(shí)還能看到條帶，但是到0.002 ng時(shí)則已無(wú)可辨別的條帶.

注：泳道M為DL2000 DNA ladder；泳道1為空白對(duì)照；泳道2～6分別為20、2、0.2、0.02、0.002 ng野葛基因組DNA圖6 野葛基因組DNA濃度梯度稀釋PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Amplification results with serial dilutions of kudzu DNA

因此該體系的定性PCR檢測(cè)極限為0.02 ng野葛基因組DNA，單倍體野葛基因組約990 Mb[14, 15]，0.02

ng基因組DNA則約含有18個(gè)拷貝的基因組DNA. 因此該體系的定性PCR檢測(cè)極限為18個(gè)拷貝的野葛基因組DNA，該檢測(cè)靈敏度高，可以滿足實(shí)際檢測(cè)的需求.

2.4 PCR檢測(cè)葛根制品中的野葛根成分

為驗(yàn)證建立的PCR方法的適用性，從市場(chǎng)購(gòu)買不同類型的葛根制品，分別為即沖型野葛粉(市售)，野葛粉(同仁堂牌)，野葛根中藥飲片(市售)，野葛代餐粉(市售)，粉葛根粉(市售)，粉葛根丁(市售)，將上述葛根制品打磨成粉末狀后提取基因組DNA，用引物組合18s rDNA F/18s rDNA R和PlCHSF/PlCHSR對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè). 結(jié)果如圖7所示，圖A中18s rDNA檢測(cè)引物對(duì)所有的葛根制品基因組DNA均有擴(kuò)增，表明成功地從這些葛根制品中提取到了基因組DNA. 圖B中野葛粉(同仁堂牌)和野葛根中藥飲片(市售)均檢測(cè)到與陽(yáng)性對(duì)照相同的條帶，因此含有野葛成分. 即沖型野葛粉(市售)，野葛代餐粉(市售)，粉葛根粉(市售)，粉葛根丁(市售)均無(wú)擴(kuò)增，因此不含有野葛成分. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的基于野葛特異性序列的引物組合能夠準(zhǔn)確鑒定出樣品中的野葛成分.

注：泳道M為DL2000 DNA ladder；泳道1為空白對(duì)照；圖A中泳道2～7分別為18s rDNA F/18s rDNA R對(duì) 6種不同的葛根制品：即沖型野葛粉(市售)，野葛粉(同仁堂牌)，野葛根中藥飲片(市售)，野葛代餐粉(市售)，粉葛根粉(市售)，粉葛根丁(市售)的擴(kuò)增結(jié)果；圖B中泳道2為野葛葉片基因組DNA陽(yáng)性對(duì)照，泳道3～8分別為PlCHS F/PlCHS R對(duì)6種不同的葛根制品的擴(kuò)增結(jié)果市售圖7 葛根制品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 PCR detection of kudzu products

3 結(jié)語(yǔ)

以特定的化學(xué)成分及其含量對(duì)物種進(jìn)行鑒定已廣泛應(yīng)用[16, 17]，但化學(xué)成分指紋圖譜分析的依據(jù)主要為植物物種后天的代謝產(chǎn)物，且大多為植物的次生代謝物，容易受到生物體的生長(zhǎng)發(fā)育階段、環(huán)境條件、人類活動(dòng)等的影響，具有較大的變異性，存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[18]. 目前，物種的分類研究已經(jīng)從過(guò)去的形態(tài)學(xué)分類轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿酉到y(tǒng)學(xué)及代謝組學(xué)研究[19]. 本研究以野葛物種特有的DNA序列為基礎(chǔ)，建立的特異性PCR檢測(cè)方法，屬于一種生物學(xué)指紋圖譜，不受樣本形態(tài)特征、組織部位的影響，對(duì)物種的鑒定更加準(zhǔn)確.

此外，目前對(duì)葛屬種質(zhì)資源的全面調(diào)查、品種選育等方面的研究和應(yīng)用較少，對(duì)于葛屬植物的分類也未有定論，《中國(guó)植物志》第四十一卷記載中國(guó)產(chǎn)葛屬8種3變種，顧志平等認(rèn)為有9種2變種[1]. 此外，葛屬種的命名也存在不規(guī)范之處，如“葛根”既有葛屬植物的塊狀根之意，又有習(xí)慣特指“野葛”或者“粉葛”. 食用葛(Puerariaedulis)有別稱葛根、葛藤、粉葛、甘葛，與粉葛又相互混淆. 本研究建立的野葛特異性檢測(cè)方法，可作為傳統(tǒng)方法的有力補(bǔ)充，用于葛屬植物的物種鑒定與分類中.

通過(guò)生物信息學(xué)和分子生物學(xué)手段篩選和鑒定出野葛特異性的DNA序列，設(shè)計(jì)了特異性引物組合PlCHSF/PlCHSR，對(duì)野葛14個(gè)不同的居群都有相同的擴(kuò)增，對(duì)20種其他植物均無(wú)擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.02 ng基因組DNA. 對(duì)市場(chǎng)上的各種葛根制品進(jìn)行檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確地鑒定出制品中是否為野葛以及是否含有野葛成分. 本研究為野葛成分的鑒定提供了一種方便、快捷、特異強(qiáng)、靈敏度高的PCR檢測(cè)方法.