豌豆根瘤菌RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)基因tpaA的功能研究

程國(guó)軍，羅莎，謝婧，吳和濤

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心,武漢 430074)

根瘤菌是一類革蘭氏陰性土壤細(xì)菌.可以與特定的宿主植物共生形成結(jié)瘤，并將空氣中的分子氮轉(zhuǎn)化為植物可以使用的氨態(tài)氮，是能與豆科植物結(jié)瘤的共生固氮細(xì)菌的總稱. 一般來(lái)說(shuō)，根瘤菌被分為6個(gè)屬，皆屬于α-變形桿菌[1]. 根瘤菌積極參與細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至宿主豆科植物的過(guò)程，以引發(fā)感染和根瘤形態(tài)發(fā)生. 根瘤菌也可利用N-?；呓z氨酸內(nèi)酯信號(hào)進(jìn)行群體感應(yīng)基因調(diào)控，增強(qiáng)與豆科植物的相互作用和在脅迫下的存活[2].

前期對(duì)豌豆根瘤菌3841的轉(zhuǎn)錄組的生物信息學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn)，tpaA基因是編碼RND外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因. 細(xì)菌的外排泵主要有5個(gè)家族，分別是易化子超家族(MFS 家族)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族、小型多藥防御家族(SMR家族)、防御結(jié)瘤分裂家族(RND家族即RND外排泵) 和多藥有毒化合物排出家族(MATE家族)[3]. 基因組分析和微陣列分析表明：主動(dòng)外排是細(xì)菌內(nèi)在耐藥性的主要機(jī)制，而RND外排泵是一種與抗生素外排直接相關(guān)的外排泵，幾乎所有的這類外排泵都與耐藥性有關(guān)[4,5]. 革蘭氏陰性細(xì)菌比陽(yáng)性細(xì)菌對(duì)抗生素顯示出更強(qiáng)的耐受性，RND外排泵的過(guò)量表達(dá)是革蘭陰性菌細(xì)菌抗生素耐藥性形成的重要原因之一[6]. 革蘭氏陰性菌RND外排泵主要由3部分組成，分別是在細(xì)胞內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即RND內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(RND efflux transporters)、細(xì)胞周質(zhì)膜融合蛋白(MFP)和細(xì)胞外膜上的孔道外排蛋白(OMF)[7]. 其中，RND內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞膜上和周質(zhì)空間藥物的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn). RND外排泵系統(tǒng)對(duì)許多抗生素具有外排作用，主要與細(xì)胞內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)[8]，所以缺少其中任一部分在細(xì)菌對(duì)藥進(jìn)行外排的過(guò)程中，都將會(huì)導(dǎo)致其耐藥性能的喪失[9]. 研究編碼外排泵系統(tǒng)蛋白的相關(guān)基因在根瘤菌共生固氮中的作用機(jī)制、并分析根瘤菌中RND外排泵功能以及其與耐藥性和致病性的關(guān)系，對(duì)于揭示根瘤菌的耐藥機(jī)制，降低致病性具有重要的指導(dǎo)意義.

R.leguminosarum3841tpaA基因編碼RND家族內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在對(duì)tpaA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建R.leguminosarum3841tpaA基因突變株，研究tpaA基因突變對(duì)根瘤菌生長(zhǎng)、抗生素耐藥性以及根瘤共生的影響，為深入闡明RND家族內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在根瘤菌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株質(zhì)粒和培養(yǎng)基

豌豆根瘤菌R.leguminosarumbv.Viciae3841、突變體構(gòu)建載體pk19mob由英國(guó)牛津大學(xué)Philip S Poole教授提供. 根瘤菌培養(yǎng)基為TY天然培養(yǎng)基或AMS基本培養(yǎng)基，大腸桿菌為L(zhǎng)B培養(yǎng)基.抗生素均購(gòu)于Sigma公司，其中篩選和培養(yǎng)大腸桿菌所用抗生素及濃度：卡那霉素(Km)20 μg/mL; 四環(huán)素(Tc)5 μg/ mL. 篩選和培養(yǎng)根瘤菌所用抗生素及濃度：四環(huán)素(Tc)2g/mL，鏈霉素(Str) 500g/mL，新霉素(Neo) 80g/mL. 實(shí)驗(yàn)所用的菌株與質(zhì)粒見(jiàn)表1.

表1 實(shí)驗(yàn)所用的菌株與質(zhì)粒Tab.1 The strains and plasmids used in this paper

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(XbaⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ等)、T4 DNA連接酶、RNAiso Plus(TaKaRa)；Phusion 高保真酶、TaqDNA 聚合酶(Thermo Scientific)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master (Rox)；PCR產(chǎn)物回收試劑盒以及DNA凝膠回收試劑盒(博大泰克公司).

1.3 R. leguminosarum tpaA 突變體的構(gòu)建

參照田夢(mèng)洋等[10]方法構(gòu)建豌豆根瘤菌tpaA基因突變體，抽提豌豆根瘤菌3841總DNA，以R.leguminosarum3841總DNA為模板，以tpaAUP/tpaALW為PCR引物擴(kuò)增得到tpaA基因片段. 研究所用PCR引物如表2.

表2 PCR引物序列
Tab.2 Sequences of the PCR primers

(5′→3′)tpaAUPAAA TCT AGA TGA GAT TAT ATC AGG GTC TGtpaALWAAA GGA TCC ACG ATG CTG GCA AGC TTG GTtpaAMapAGA TCC GTC TGC TTG AAG GTpK19AATC AGA TCT TGA TCC CCT GCpK19BGCA CGA GGG AGC TTC CAG GGQtpaAUPAGGAATACGACCGGCAGCTCQtpaALWGAGATCGAGATTGGCCTGAGgyrB1UPGGC ATC ACC AAA AGG GAA AAgyrB1LWGCG AGG AGA ATT TCG GAT CA

注：下劃線為限制性酶切位點(diǎn)

將擴(kuò)增得到的目的片段與載體pK19mob分別用XbaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞. 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證正確后，獲得tpaA基因突變體構(gòu)建質(zhì)粒pKtpaA. 以R.leguminosarum3841為受體菌，含pRK2013質(zhì)粒的大腸桿菌為輔助菌，含pKtpaA質(zhì)粒的大腸桿菌為供體菌進(jìn)行三親本雜交，獲得的轉(zhuǎn)移接合子，通過(guò)抗性篩選后用引物tpaAMap/pK19A或 tpaAMap/pK19B對(duì)接合子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，篩選tpaA基因突變株RLtpaA.

1.4 菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

將野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpa接種到含相應(yīng)抗生素的TY斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后用AMS液體培養(yǎng)基洗脫，重懸接種到AMS液體培養(yǎng)基或TY液體培養(yǎng)基中，初始OD600為0.01，在30 ℃，200 r/min的恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)OD600. 包括下面各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)在內(nèi)，所有菌株實(shí)驗(yàn)均3組重復(fù).

1.5 抗生素抗性實(shí)驗(yàn)

將野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpaA接種到含相應(yīng)抗生素的TY培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)1 d后用3 mL不含抗生素的TY液體培養(yǎng)基洗脫，取10 μL 103CFU菌液點(diǎn)樣在分別含有鏈霉素(750g/mL，500g/mL，250g/mL)、氯霉素(5g/mL)、四環(huán)素(1g/mL)、壯觀霉素(5g/mL)、氨芐青霉素(10g/mL,50g/mL,100g/mL)的TY培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)突變體和野生型菌落的生長(zhǎng)情況[11].

1.6 接種植株共生固氮酶活的測(cè)定

采用無(wú)菌蛭石種植甜豌豆[12]. 將消毒后的豌豆種子播種于已滅菌的蛭石燒杯內(nèi)，再分別接種野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpaA菌液，每顆豌豆上接種1 mL菌液. 播種完成后用保鮮膜封口，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后挑破幼苗上的保鮮膜，并定期澆灌營(yíng)養(yǎng)液，4周后用乙炔還原法測(cè)定根瘤固氮酶活性.

1.7 qRT-PCR分析tpaA基因在根瘤中的表達(dá)

野生型3841菌株接種豌豆植株，培養(yǎng)25 d后采集豌豆植株，采用Trizol法提取類菌體總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 以AMS培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期3841菌株為對(duì)照，對(duì)類菌體中的tpaA基因進(jìn)行熒光定量PCR分析. qRT-PCR引物見(jiàn)表2，gyrB1基因?yàn)閮?nèi)參.

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆根瘤菌3841 tpaA生物信息學(xué)分析

在NCBI上通過(guò)基因序列分析發(fā)現(xiàn)豌豆根瘤菌3841tpaA基因編碼RND家族內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖1)，含有399個(gè)氨基酸. RND外排泵 (resistance-nodulation-cell division family)即耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化家族，能夠從胞內(nèi)和細(xì)胞周質(zhì)中捕獲底物并有效地排到胞外，減少抗生素在菌體內(nèi)積聚[13]. 細(xì)菌中幾乎所有RND類外排泵都與耐藥性相關(guān)，其中，革蘭陰性菌的耐藥性主要由RND外排泵引起[14].

圖1 豌豆根瘤菌3841中TpaA蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of the protein domains of TpaA in R. leguminosarum 3841

2.2 豌豆根瘤菌tpaA突變菌株的構(gòu)建

以豌豆根瘤菌3841為受體菌，含pRK2013質(zhì)粒的大腸桿菌菌株為輔助菌，含pKtpaA質(zhì)粒的大腸桿菌為供體菌進(jìn)行三親本雜交后，通過(guò)抗性篩選及用引物tpaAMap/pK19A或tpaAMap/pK19B為引物對(duì)接合子進(jìn)行PCR驗(yàn)證后表明，tpaA基因突變株RLtpaA構(gòu)建成功.

2.3 tpaA基因突變對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

活化的RLtpaA菌株與野生型3841菌株生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明(圖2, 3)，在AMS基本培養(yǎng)基中，前20 h野生型3841菌株比突變體RLtpaA菌株生長(zhǎng)更快，表明tpaA基因突變會(huì)使豌豆根瘤菌延遲生長(zhǎng). 而在TY天然培養(yǎng)基中，野生型3841菌株和突變體RLtpaA菌株生長(zhǎng)變化趨勢(shì)相同，tpaA基因突變不影響豌豆根瘤菌在天然培養(yǎng)基中的正常生長(zhǎng)(圖3).

圖2 AMS培養(yǎng)基中3841與RLtpaA菌株的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of 3841 and RLtpaA in AMS medium

圖3 TY培養(yǎng)基中3841與RLtpaA的生長(zhǎng)情況Fig.3 The growth of 3841 and RLtpaA in TY medium

2.4 tpaA基因突變對(duì)根瘤菌抗生素抗性的影響

將活化的野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpaA在分別含有不同濃度的多種抗生素的TY培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，在選擇性抗生素培養(yǎng)基中野生型菌株3841比突變體菌株RLtpaA表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗生素抗性(表3)，由于RND家族外排泵的表達(dá)是革蘭陰性菌細(xì)菌抗生素耐藥性形成的重要原因之一，表明tpaA基因突變可能會(huì)抑制根瘤菌中的RND家族外排泵的表達(dá)，從而降低其抗生素耐藥性.

表3 根瘤菌菌株對(duì)抗生素的敏感性Tab.3 The sensitivity of Rhizobium strains to antibiotics

注：+++,++,+ 表示生長(zhǎng)狀況良好、一般、不好

2.5 豌豆盆栽實(shí)驗(yàn)

盆栽4周后，接種了tpaA基因突變株RLtpaA的豌豆植株形成紅色有效根瘤. 將接種根瘤菌的豌豆植株利用乙炔還原法測(cè)定根瘤固氮酶活性，突變株接種植株比野生型接種植株的固氮酶活性減少了10.5% (圖4)，表明tpaA基因突變對(duì)根瘤菌的固氮酶活性有一定的影響.

圖4 豌豆根瘤菌3841和突變菌株RLtpaA的固氮酶活性Fig.4 The symbiotic nitrogenase activity of RLtpaA and 3841

2.6 tpaA基因在根瘤類菌體中的表達(dá)

熒光定量RT-PCR分析tpaA基因在根瘤類菌體中的表達(dá)量，結(jié)果表明在形成25 d根瘤類菌體中表達(dá)量為在自生條件下的2.37±0.29倍. 統(tǒng)計(jì)分析表明，tpaA基因的表達(dá)達(dá)到顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明tpaA基因的表達(dá)受根瘤共生環(huán)境的誘導(dǎo).

3 討論

抗生素耐藥性一直是細(xì)菌性疾病防治中的一個(gè)難題.細(xì)菌的外排泵可以增強(qiáng)細(xì)菌耐抗生素的能力， 而外排泵的過(guò)量表達(dá)是細(xì)菌耐藥性形成的重要機(jī)制之一. RND多耐藥外排泵對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥性貢獻(xiàn)很大，在大腸桿菌和銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的以耐藥結(jié)節(jié)分化家族為代表的多耐藥外排泵成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[15].

tpaA基因編碼RND外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該基因突變會(huì)使根瘤菌在基本AMS培養(yǎng)基生長(zhǎng)延遲，但不影響其在天然培養(yǎng)基TY中的正常生長(zhǎng). 說(shuō)明失去該基因之后，細(xì)菌生長(zhǎng)受到了部分抑制，這可能是因?yàn)榫晟L(zhǎng)到一定階段后，細(xì)胞內(nèi)通過(guò)代謝產(chǎn)生的不利產(chǎn)物不能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)排出體外，從而影響菌體生長(zhǎng)繁殖.tpaA基因突變株接種豌豆植株能形成紅色有效根瘤，但其固氮酶活酶減少了10.5%，表明tpaA基因突變對(duì)根瘤菌的共生酶活有一定的影響. Takeshima等[16]發(fā)現(xiàn)用染料木黃酮處理大豆根瘤菌后，外排泵基因受到誘導(dǎo)表達(dá)明顯上調(diào). 本研究也表明tpaA基因在根瘤類菌體中的表達(dá)顯著上調(diào)且顯著差異. Eda等[17].通過(guò)調(diào)控寄主植物中抑菌化合物的分泌，證明了苜蓿根瘤菌主要外排系統(tǒng)SmeAB對(duì)結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)力起到了重要作用野生型菌株3841比突變體菌株RLtpaA表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗生素抗性. 由于RND家族外排泵的表達(dá)是革蘭氏陰性菌抗生素耐藥性形成的重要原因之一，表明tpaA基因突變可能會(huì)抑制根瘤菌中的RND家族外排泵的表達(dá)，從而使得其抗生素耐藥性降低. 已有研究發(fā)現(xiàn)RND外排泵引起銅綠假單胞菌耐藥性及影響其致病性.雖然細(xì)菌外排泵的研究歷史較長(zhǎng)，但根瘤菌中外排泵的報(bào)道較少，外排泵系統(tǒng)相關(guān)基因在根瘤菌共生固氮中的作用機(jī)制值得深入研究.