北疆地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

章 蓮，武 磊，高建鵬，汪驍軒，趙 鑫，齊亞銀，張 莉*

（1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆克拉瑪瑞恒畜牧開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，新疆 克拉瑪依 834000）

副豬嗜血桿菌?。℉ps）：稱革拉澤氏病，可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等癥狀[1]。其致病菌為革蘭氏陰性小桿菌，巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的成員。此病原菌主要危害1～4月齡的仔豬和保育豬，該病的病死率為達(dá)15%，嚴(yán)重感染時(shí)高達(dá)50%[2]。副豬嗜血桿菌為健康豬群的常在菌，以前多為散發(fā)[3]。隨著現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，飼養(yǎng)密度也隨之變大，豬群的環(huán)境衛(wèi)生受到了限制，副豬嗜血桿菌病的病死率有呈上升的趨勢(shì)。尤其在豬群發(fā)生支原體、偽狂犬、高致病性藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病等疫病時(shí)，更易引起此病的發(fā)生，給豬場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著HPS病的流行，在世界各地均有報(bào)道過(guò)該病的發(fā)生[4]。目前，副豬嗜血桿菌的致病機(jī)理尚不清楚。據(jù)研究表明，強(qiáng)毒株可破壞鼻粘膜，進(jìn)入血液，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。從而通過(guò)血腦屏障，最終造成腦膜炎的發(fā)生[5-7]。該菌主要存在于豬的上呼吸道，通過(guò)直接接觸、空氣和污染物傳播。此外，帶菌豬和慢性感染豬使得病原菌長(zhǎng)期存在，給豬群健康帶來(lái)威脅。

2018年秋季以來(lái)，北疆三個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)病豬陸續(xù)出現(xiàn)呼吸困難、發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫大、跛行等疑似副豬嗜血桿菌的典型癥狀。剖檢可見(jiàn)，病死豬的氣管內(nèi)有大量泡沫樣分泌物，肺臟出現(xiàn)典型的纖維素樣病變。心臟出血，外附有一層黃白色纖維素樣滲出物，心包和胸腹腔有大量積液。據(jù)了解，A場(chǎng)發(fā)病豬病死率為21%，B場(chǎng)發(fā)病豬病死率為14%，C場(chǎng)發(fā)病豬病死率為10%。為科學(xué)防控該病，本試驗(yàn)采集有HPS典型癥狀的病死豬肺臟、淋巴結(jié)和胸腹腔滲出液等病料，選擇TSA培養(yǎng)基進(jìn)行致病菌的分離，采用生理生化特性及基于PCR的分子特性對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 病死豬肺臟、胸腹腔積液、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液和心包液進(jìn)行分離。金黃色葡萄球菌來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 主要儀器 冰箱、PCR儀、震蕩培養(yǎng)箱、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、Bio凝膠成像儀、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)。

1.1.3 主要試劑 TSB（胰蛋白大豆肉湯）、TSA（胰蛋白大豆瓊脂）培養(yǎng)基等均購(gòu)自青島海博有限公司；生化鑒定管、NAD（v因子，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）和細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司。

1.1.4 藥物 選用四環(huán)素、青霉素、頭孢噻肟、氨芐西林、洛美沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、林可霉素、利福平、阿莫西林等共14種。

1.1.5 生化鑒定管 氧化酶、阿拉伯糖、山梨醇、脲酶、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、吲哚、麥芽糖、硝酸鹽還原酶、硫化氫等14種生化培養(yǎng)基。

1.1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡健康昆明系小鼠來(lái)源于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 無(wú)菌采集病料，用接種環(huán)將其無(wú)菌接種于TSA平板上（NAD和小牛血清），于5% CO2條件下，73 ℃培養(yǎng)24～36 h，鏡檢觀察菌體形態(tài)。同時(shí)將可疑菌落接種鮮血瓊脂平板。

1.2.2 染色鏡檢 挑取單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 生化鑒定 挑取鮮血瓊脂平板上的單菌落，無(wú)菌接種于生化鑒定培養(yǎng)基（添加NAD）中，37℃培養(yǎng)16～48 h后，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。

1.2.4 P C R檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[8]中的特異性引物進(jìn)行P C R擴(kuò)增，H P S-F: 5′—GGCTTCGTCACCCTGTG— 3′；HPS-R: 5′—GTCAGAGGAAGGGTGGT— 3′；預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為821bp。

反應(yīng)體系（25ul）：上游引物 1uL，下游引物 1μL，Mix 12.5ul，ddH2O 8.5ul，模板 2ul。其反應(yīng)條件為：94℃ 4 min；94 ℃ 50 s；59℃ 50 s；72℃ 50s；32個(gè)循環(huán)后；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。制備1%的瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳，成像后觀察結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 無(wú)菌吸取分離菌株的TSB純培養(yǎng)物0.2 ml于TSA平板上，用高壓滅菌的涂布棒將菌液涂布均勻。將藥敏紙片貼于TSA平板上，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌圈大小。參照美國(guó)CLSI推薦的判定方法，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑，進(jìn)行分離株對(duì)藥物的敏感性分析。

1.2.6 致病性試驗(yàn) 將30只小鼠將其分為6組（組/5只），設(shè)一組為對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)組注射相同劑量的同一毒株菌液，分別對(duì)5組實(shí)驗(yàn)組小組進(jìn)行腹腔注射0.2 ml/只（濃度為1×107cfu /ml）。觀察小鼠的感染情況，對(duì)病死小鼠進(jìn)行剖檢，采集心血進(jìn)行致病菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

將病料接種于TSA平板，培養(yǎng)36 h后，可見(jiàn)無(wú)色透明、直徑為1 mm左右、圓形的單個(gè)菌落，見(jiàn)圖1所示。結(jié)果從病料中共分離出5株疑似副豬嗜血桿菌分離株，分別編號(hào)為XJS1-2（A 場(chǎng) ）、XJS3-6、XJS3-9（B場(chǎng) ）、XJS7-7、XJS7-W（C場(chǎng)）。同時(shí)將這5株分離菌株無(wú)菌接種于TSB培養(yǎng)基（含0.2g/L的NAD和50mL/L的犢牛血清）中，放于震蕩培養(yǎng)箱中37℃搖菌培養(yǎng)16 h后，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 細(xì)菌分離結(jié)果

2.2 染色鏡檢

革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果見(jiàn)圖2所示?？梢?jiàn)分離菌為革蘭氏陰性菌，形態(tài)各不相同，視野內(nèi)可見(jiàn)有長(zhǎng)桿狀、球狀、短桿狀的菌體，但大多數(shù)為小桿菌，少數(shù)為長(zhǎng)桿狀和球狀的菌體。

圖2 分離菌株鏡檢結(jié)果（倍數(shù)100×10）

2.3 生化試驗(yàn)

對(duì)不同地區(qū)HPS分離株進(jìn)行生理生化鑒定。結(jié)果顯示大部分分離株可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖，不發(fā)酵D-核糖、木糖、吲哚和阿拉伯糖。硫化氫試驗(yàn)、脲酶、山梨醇、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，觸酶陽(yáng)性。分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果表明這5株分離株生化試驗(yàn)結(jié)果符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

表1 分離菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)抑菌圈大小，對(duì)每一株分離株進(jìn)行藥物的敏感性試驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2所示。XJS3-6和XJS3-9對(duì)恩諾沙星最為敏感；XJS1-2對(duì)頭孢噻肟最為敏感；XJS7-W對(duì)磺胺異惡唑最為敏感；XJS7-7對(duì)四環(huán)素最為敏感。

表2 部分分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 PCR檢測(cè)結(jié)果

用細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)分離菌的DNA進(jìn)行提取，作為PCR擴(kuò)增的模板，4℃保存?zhèn)溆?。?jīng)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳成像后可見(jiàn)5株分離菌株均擴(kuò)增出大小約為821 bp的片段，與目的片段相一致。

圖3 PCR反應(yīng)結(jié)果

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1.陰性對(duì)照；2.XJS1-2；3. XJS3-6；4. XJS3-9；5. XJS7-W；6.XJS7-7

2.6 致病性試驗(yàn)

對(duì)照組小鼠均正常，實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)行動(dòng)緩慢，48h內(nèi)，試驗(yàn)組XJS1-2中，有3只小鼠死亡，XJS3-6X、JS3-9組有4只小鼠死亡，實(shí)驗(yàn)組XJS7-W和 XJS7-7小鼠均死亡，取病死小鼠心血無(wú)菌接種于TSA中，結(jié)果分離并鑒定出副豬嗜血桿菌。

3 討論

副豬嗜血桿菌（HPS）具有明顯的宿主專一性。于1910年，Glasse首次報(bào)道該菌。1922年才首次成功分離到HPS，在臨床病例中的分離率很低，僅30%左右，尤其是在死亡12h以后的病死豬組織中，很難分離成功[9]。HPS對(duì)培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，需要v因子（NAD）和血清，在含NAD和血清的TSA平板上生長(zhǎng)較好。研究表明，從病料中，分離該菌最好在12h之內(nèi)，否則很難再分離出HPS[10]。由于在臨床病料分離時(shí)，易被雜菌污染，在一定程度上阻礙了研究人員對(duì)副豬嗜血桿菌的研究。生產(chǎn)中，大量使用抗生素降低了該菌的分離率。

PCR技術(shù)用于臨床檢測(cè)，可以快速而準(zhǔn)確地從病料中檢出病原體，早在2001年，Oliveira S等[11]根據(jù)16S rDNA設(shè)計(jì)引物，并建立了HPS的PCR診斷方法，但HPS與吲哚放線桿菌16S rDNA的同源性很高[12]。本試驗(yàn)通過(guò)16S rDNA設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，可快速、準(zhǔn)確的檢出病原菌，避免了高同源性的缺點(diǎn)。

副豬嗜血桿菌具有明顯的地方流行性，不同地方流行株的血清型有所不同。副豬嗜血桿菌的血清型眾多，至少可將其血清型分為15個(gè)血清型，另外還有20%以上的菌株無(wú)法定型，我國(guó)流行的血清型以 1、4、5和13型為主[13]。血清型和毒力之間存在差異，不同的血清型之間很難產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)[14-16]。故建議使用當(dāng)?shù)亓餍械姆蛛x株進(jìn)行藥物敏感性分析和疫苗的制備，對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)的生產(chǎn)用藥和預(yù)防才具有實(shí)際意義。從本試驗(yàn)的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果可看出，大部分分離菌株對(duì)喹諾酮類藥物較敏感。此外，有研究者表明，金銀花及其復(fù)方對(duì)副豬嗜血桿菌抑制作用明顯[17]。不同地區(qū)分離菌株對(duì)藥物的敏感程度有所差異，這于流行株的血清型以及豬場(chǎng)臨床用藥息息相關(guān)，使部分菌株對(duì)頭孢類藥物產(chǎn)生了耐藥性。