獐寶治療胃癌前病變的機(jī)制研究△

王媛媛，鄭亮，姜正艷

南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（江蘇省第二中醫(yī)院）脾胃病科，南京 210017

胃癌是嚴(yán)重危害人們健康的疾病，起病隱匿，早期常因無明顯癥狀而漏診，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后差。胃癌的發(fā)生很少直接從正常胃黏膜上皮產(chǎn)生，而是在癌變前經(jīng)歷相當(dāng)長的演變過程。現(xiàn)今，國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的胃癌發(fā)病模式為：慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）→腸化生（intestinal metaplasia，IM）→異型增生[dysplasia，Dys；不典型增生，現(xiàn)歸于上皮內(nèi)瘤變（intraepithelial neoplasia，IN）]→胃癌。2000年WHO公布的新版消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類中[1]，將IN和腸化生視為胃癌的癌前病變（precancerous lesion of gastric cancer，PLGC）[2]。目前胃癌的治療手段仍不能降低其高病死率，所以，PLGC的早診斷、早治療，是提高胃癌患者生存率的唯一有效措施?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對治療CAG及PLGC尚無理想的療法，而中醫(yī)治療具有一定優(yōu)勢。其講究整體觀念，重視辨證論治，藥食兼顧，綜合治療，彌補(bǔ)西藥治療片面的不足，療效肯定，不良反應(yīng)小。獐寶是鹿科動物幼獐吮吸獐奶后在胃中凝結(jié)的奶塊，屬于名貴稀有藥材，早在《本草綱目》中就有記載，主要用于小兒疳積、功能性消化不良等。江蘇省第二中醫(yī)院脾胃病科鄭亮教授運(yùn)用獐寶治療慢性萎縮性胃炎PLGC臨床取得滿意療效。基于臨床研究前的動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，獐寶治療大鼠CAG，逆轉(zhuǎn)腸上皮化生、輕度-中度不典型增生有較好療效[3]。本研究旨在進(jìn)一步探討獐寶治療PLGC的機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

14只清潔級Wistar雄性大鼠由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，體重為180～220 g，共分為4組，每組3只，剩余2只16周時取樣觀察造模情況。胃復(fù)春購自杭州于慶堂制藥有限公司，獐寶購自南京萬御寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組將12只雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型對照組、胃復(fù)春治療組、獐寶治療組，每組3只大鼠。

1.2.2 造模采用MNNG自由飲水法配合抑酸、饑飽失常及脫氧膽酸鈉、乙醇灌胃法聯(lián)合造模，空白組給予等量生理鹽水灌胃。于造模16周末將待觀察造模情況的2只大鼠，取胃竇及胃體組織各1塊，采用常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxyli-eosin，HE）染色，用20%福爾馬林固定后，光鏡下觀察胃黏膜均存在萎縮，且出現(xiàn)腸上皮化生和不典型增生，確認(rèn)造模成功。

1.2.3 給藥處理造模16周后，獐寶治療組給予獐寶56 mg/kg灌胃，胃復(fù)春治療組給予胃復(fù)春25.13 ml/kg灌胃，空白組、模型對照組給予生理鹽水10 ml/kg灌胃，每日1次，每周6次，連續(xù)給藥時間均為12周。

1.2.4 樣本取材給藥12周后處死大鼠，剖腹取胃，在胃大彎側(cè)剖開全胃，取出0.2 cm×0.2 cm長條形胃組織，迅速放于4%甲醛溶液中固定，24 h后用石蠟包埋，進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察胃黏膜變化（胃組織實(shí)驗(yàn)前保存于4℃條件下）。

1.3 HE染色

HE染色后觀察各組大鼠胃黏膜、血管生成、炎癥細(xì)胞浸潤情況。由專業(yè)病理人員在光學(xué)顯微鏡下閱片，根據(jù)病變輕重程度不同，依次標(biāo)記為“-”“+”“++”“+++”，分別賦值為0、1、2、3分，其中“-”為無明顯病理改變，“+++”為嚴(yán)重的病理改變。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測

應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測方法通過特異性抗體檢測各組胃組織中熱休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）、熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，HSP90）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 assaciated X protein，BAX）、存活蛋白（survivin）的表達(dá)。具體方法：首先白片37℃烤過夜，予梯度乙醇脫水，二甲苯1，2，3各10 min，100%、95%、90%、80%、70%、50%乙醇各2 min，蒸餾水1 min，Tris-HCl緩沖鹽溶液（Tris-HCl buffered saline，TBS）洗3次，每次5 min，待抗原修復(fù)后自然冷卻，TBS洗3次，每次5 min，將切片放入3%H2O2溶液，室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后TBS洗3次，每次5 min，甩干后予5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉20 min，去除BSA液，每張切片加入50 μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過夜，再TBS洗3次，每次5 min，去除磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），每張切片加入 50～100 μl相應(yīng)的二抗，于4℃孵育50 min，TBS洗3次，每次5 min，去除TBS液，每張切片再加入50～100 μl新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，顯微鏡控制顯色后，用蒸餾水沖洗，蘇木素染色25 s，之后用自來水沖洗3～5 min返藍(lán)，蒸餾水1 min，然后50%、70%、80%、90%、100%乙醇分別浸泡1 min，二甲苯1，2，3分別浸泡數(shù)分鐘，晾干，滴加中性樹膠，然后封片。

結(jié)果分析方法：采用圖像分析系統(tǒng)對上述蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取3個完整而不重疊的高倍視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度值作為表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色評分比較，模型對照組、獐寶治療組、胃復(fù)春治療組均高于空白組，獐寶治療組與胃復(fù)春治療組均低于模型對照組，胃復(fù)春治療組高于獐寶治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。HE染色結(jié)果顯示，空白組胃黏膜上皮完整，表面光滑，無糜爛，細(xì)胞形態(tài)均一，腺體排列整齊，散在少量淋巴細(xì)胞，固有層無炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層無水腫。模型對照組胃黏膜部分腺體萎縮消失，黏膜肌層的平滑肌呈束狀增生插入黏膜固有層，腺管腔變大，病變黏膜固有層可見慢性炎癥細(xì)胞浸潤，且浸潤深達(dá)黏膜肌層，甚至有淋巴細(xì)胞聚集及淋巴濾泡形成，基底部腺體上皮增生，可見杯狀細(xì)胞，核深染，有腸上皮化生及低級別IN。胃復(fù)春治療組胃黏膜上皮較模型對照組完整，細(xì)胞形態(tài)比較均一，固有腺體排列齊密，散在少量淋巴細(xì)胞，腺上皮和腺管分界清楚，炎癥細(xì)胞浸潤主要局限于黏膜淺層。獐寶治療組胃黏膜厚度適中，腺體排列較規(guī)則，部分黏膜固有層有少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞，偶見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞及腺細(xì)胞形態(tài)無異型（圖1）。

表1 各組HE染色評分的比較（±s）

表1 各組HE染色評分的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.05；b與模型對照組比較，P＜0.05；c與獐寶治療組比較，P＜0.05

組別空白組模型對照組獐寶治療組胃復(fù)春治療組F值P值0±0 2.78±0.44a 1.22±0.44a b 1.88±0.35a b c 32.240 0.000 HE染色評分

圖1 各組大鼠胃黏膜的病理結(jié)果（HE染色，×400）

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

模型對照組胃黏膜組織中HSP60、HSP90、Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)量均低于空白組，BAX蛋白表達(dá)量高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；獐寶治療組胃黏膜組織中HSP60、HSP90、Bcl-2、survivin蛋白表達(dá)量均高于模型對照組，BAX蛋白表達(dá)量低于模型對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2、表3）

表2 各組胃黏膜組織中HSP60、HSP90表達(dá)量的比較（±s）

表2 各組胃黏膜組織中HSP60、HSP90表達(dá)量的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.05；b與模型對照組比較，P＜0.05

組別空白組模型對照組獐寶治療組胃復(fù)春治療組F值P值63.42±9.19 24.99±3.33a 40.35±4.08a b 30.93±4.11a 26.52 0.000 66.03±5.75 18.66±4.14a 42.16±9.83a b 32.59±6.98a 24.39 0.000 HSP60 HSP90

表3 各組胃黏膜組織中Bcl- 2、BAX、survivin表達(dá)量的比較（±s）

表3 各組胃黏膜組織中Bcl- 2、BAX、survivin表達(dá)量的比較（±s）

注：a與空白組比較，P＜0.05；b與模型對照組比較，P＜0.05

組別空白組模型對照組獐寶治療組胃復(fù)春治療組F值P值57.82±6.37 27.03±6.56a 42.16±6.47b 34.91±5.90a 12.86 0.002 20.75±4.61 64.60±6.61a 34.63±6.69a b 42.45±5.75a b 28.27 0.000 59.50±7.46 24.95±5.68a 41.62±4.93a b 35.30±3.86a 19.85 0.001 Bcl-2 BAX survivin

3 討論

近年來研究表明，細(xì)胞凋亡的異常是胃黏膜癌變的重要原因之一。胃黏膜癌變啟動階段可能存在著活躍的細(xì)胞增殖和大量細(xì)胞凋亡共存的現(xiàn)象[4]。Bcl-2在凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，是保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的重要凋亡抑制基因[5]。BAX也是Bcl家族中的一員，具有抑制Bcl-2，促進(jìn)凋亡的作用。抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白BAX的比例在維持體內(nèi)平衡中起重要作用，Bcl-2蛋白表達(dá)占優(yōu)勢時可使細(xì)胞免遭凋亡；反之，BAX蛋白表達(dá)占優(yōu)勢時則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，擁有最強(qiáng)的凋亡抑制作用[6]，具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等作用。本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型對照組大鼠Bcl-2、survivin表達(dá)減少，BAX表達(dá)增加正印證了癌變初期存在細(xì)胞凋亡活躍現(xiàn)象。而獐寶治療組可以增加Bcl-2、survivin表達(dá)，減少BAX表達(dá)，從而避免凋亡過度激活。HSP又稱作應(yīng)激蛋白（stress protein，SP）[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HSP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系[8]。HSP60是原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的分子伴侶，可能參與了腫瘤特殊信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在胃黏膜炎性反應(yīng)、萎縮和癌變中的作用近年來也越來越受到重視。在胃黏膜萎縮初期，HSP60蛋白表達(dá)是增加的。隨著萎縮程度的加重，表達(dá)反而下降，疾病進(jìn)展過程中呈現(xiàn)出雙向性。一般認(rèn)為HSP60具有抗凋亡作用。HSP90不僅參與蛋白的運(yùn)輸、解聚以及保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境壓力，同時還參與了抗感染、腫瘤免疫、自身免疫，可能對腫瘤細(xì)胞的增殖和存活起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型對照組HSP60、HSP90蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），與模型對照組相比，獐寶治療組HSP60、HSP90蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；這一結(jié)果與部分文獻(xiàn)報道不一致[9-10]，可能因?yàn)橐陨现笜?biāo)同時具有抗凋亡和促凋亡的作用，使之在惡性腫瘤的表達(dá)中呈現(xiàn)雙向性，即促進(jìn)凋亡或抑制凋亡。CAG向胃癌的發(fā)展是個多步驟緩慢的過程，是正常細(xì)胞增殖與凋亡平衡打破的過程，這一過程非常微妙，一些目前仍未知的凋亡通路中的蛋白表達(dá)決定了對凋亡的影響，本研究得出的結(jié)果是在不同個體的同一疾病狀態(tài)下凋亡蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證以上推論還需要監(jiān)測同一個體在不同疾病狀態(tài)下凋亡蛋白的表達(dá)。

綜上所述，胃PLGC造模后，細(xì)胞凋亡處于活躍狀態(tài)。而給予胃復(fù)春及獐寶治療一定程度可減少凋亡的過度激活，且獐寶的治療效果較為顯著。