不同碳氮源培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種及栽培試驗

楊心如 劉瑞香，* 郭占斌 曹 莉

（1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院/草地資源教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010011；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙漠治理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010011；3內(nèi)蒙古益稷生物科技有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010011）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草，武氏蟲草、蛹草等。它寄生于夜蛾科昆蟲蛹上，真菌分類學(xué)上與冬蟲夏草相似，是一種藥用兼食用真菌[1]。蛹蟲草的有效成分及藥理作用與冬蟲夏草相似，甚至高于冬蟲夏草，蛹蟲草已被認(rèn)為是理想冬蟲夏草的替代品[2-4]。蟲草多糖是蟲草中含量最高活性物質(zhì)，具有刺激機體產(chǎn)生抗體、增強免疫力以及抗腫瘤活性[5]，蟲草多糖的含量與蛹蟲草功效直接相關(guān)。

液體菌種在蛹蟲草人工栽培中已經(jīng)廣泛應(yīng)用[1-10]。液體培養(yǎng)基中碳氮源的種類、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件都會影響蛹蟲草液體培養(yǎng)菌絲的生長。目前對蛹蟲草液體培養(yǎng)的研究主要集中在不同液體培養(yǎng)基配方對液體菌絲體生物量和菌絲體有效成分含量的影響，關(guān)于不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的液體菌種對子實體生長及其活性成分含量影響的研究較少。菌絲生物量是衡量菌種質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，子實體產(chǎn)量又是菌種質(zhì)量的體現(xiàn)，蟲草多糖含量決定了蟲草質(zhì)量。為此，筆者對培養(yǎng)蛹蟲草液體培養(yǎng)基的碳、氮源進行單因素比較試驗以及培養(yǎng)菌種栽培蛹蟲草比較試驗，通過測定蛹蟲草液體培養(yǎng)菌絲生物量、子實體鮮重及蟲草子實體多糖含量，分析不同碳氮源對液體菌種和蛹蟲草子實體產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，找到最佳碳源、氮源及其適宜濃度，以達(dá)到提高蛹蟲草質(zhì)量和產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

蛹蟲草菌株04-18由內(nèi)蒙古益稷生物科技有限公司提供。

液體培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯250 g（去皮煮汁）、葡萄糖25 g，蛋白胨10 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀1.2 g，磷酸氫二鉀1.8 g，維生素B115 mg，維生素B610 mg，用水定容至1000 mL，并用10%硫酸溶液將pH調(diào)至6.5。

栽培蛹蟲草培養(yǎng)基：大米30 g，營養(yǎng)液40 mL。營養(yǎng)液配方：黃豆50 g，全脂奶粉25 g，5%硫酸鎂50 mL，11% 磷酸二氫鉀 50 mL，0.2%VB150 mL，0.2%VB650 mL，加水定容至5000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 碳、氮單因素比較試驗

碳源試驗：將液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖替換為供試碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖），其他成分含量不變，每種碳源濃度均為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L，處理3次重復(fù)。按試驗設(shè)計將配制好的液體培養(yǎng)基以100 mL/瓶分裝，高溫高壓滅菌后在無菌環(huán)境下冷卻至室溫。無菌條件下接入100 μL菌種，22～24℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床上搖培5～6 d。

氮源試驗：將液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨替換為供試氮源（硫酸銨、蛋白胨、酵母粉、尿素），其他成分含量不變，每種氮源濃度均為6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L，每個處理3次重復(fù)。接種、培養(yǎng)等同碳源試驗。

1.2.2 液體菌種應(yīng)用試驗

配制的栽培蛹蟲草固體培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后在無菌環(huán)境下冷卻至室溫，將1.2.1中培養(yǎng)好的液體菌種用高速分散均質(zhì)機打碎，稀釋5倍后用無菌噴槍均勻噴灑培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)盒15 mL，每種處理對應(yīng)50盒（50個重復(fù)）。溫度19～23℃、空氣相對濕度50%～60%的避光培養(yǎng)7～8 d，待大米培養(yǎng)基表面布滿白色菌絲并見底部有扎根現(xiàn)象后，在溫度20～23℃、空氣相對濕度為 50%～60%、光照培養(yǎng)45 d。摘取蛹蟲草子實體，稱量（每盒鮮重）。

1.3 測定方法

1.3.1 液體菌種培養(yǎng)及菌絲干重測定

按1.2.1中所述方法培養(yǎng)液體菌種，培養(yǎng)結(jié)束以1500 r/min離心15 min，收集菌絲球，用蒸餾水沖洗2～3次，將菌絲球放至已烘干稱重的培養(yǎng)皿中，在80℃下烘干至恒重。每個處理3個重復(fù)。

1.3.2 蟲草多糖的提取與測定

（1）多糖提取：選用超聲波-酶法提取[11]蟲草粗多糖。

（2）Sevag法脫蛋白：將上步提取獲得的蟲草粗多糖加適量蒸餾水溶解，加入溶液1/5體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇體積比為4∶1），用磁力攪拌器攪拌30 min，離心（7500 r/min），棄去中間變性蛋白及下層有機相，得到多糖溶液并定容至100 mL容量瓶中待測。

（3）多糖含量的測定：以苯酚-硫酸法[12]測定蛹蟲草子實體中多糖含量。

試驗所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0095x+0.1157，R2=0.9993。取0.5 mL多糖待測溶液，加蒸餾水補至1 mL，按照測定葡萄糖吸光度步驟操作進行吸光度測定并計算多糖百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源試驗結(jié)果

由圖1可見，碳源為蔗糖和葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草菌絲干重顯著高于麥芽糖和乳糖為碳源（P＜0.05）的菌絲干重，并且在蔗糖濃度為30 g/L時，菌絲干重最高，為1.01 g/100 mL。

蔗糖濃度為25 g/L和30 g/L時的菌絲干重均顯著高于濃度為10 g/L和20 g/L（P＞0.05），其他三種碳源不同濃度間菌絲干重?zé)o明顯差異。

由此可知，蔗糖濃度25～30 g/L最適蛹蟲草菌絲生長。蛹蟲草菌絲體對蔗糖利用率較高，葡萄糖次之。

圖1 碳源試驗菌絲干重測定結(jié)果

2.2 氮源試驗結(jié)果

蛹蟲草自身合成蛋白質(zhì)及核酸需要氮源，菌絲生長對氮源的利用有很大的選擇性[18]。由圖2可見，在硫酸銨、酵母粉、蛋白胨的液體培養(yǎng)基中蛹蟲草菌絲能夠生長，尿素為氮源的液體培養(yǎng)基中無菌絲生長，說明蛹蟲草對氮源有選擇性。

由圖2可見，酵母粉作為氮源，供試濃度菌絲干重都顯著高于氮源硫酸銨（P＜0.05），在其濃度為6 g/L、8 g/L、12 g/L時，菌絲干重顯著高于氮源蛋白胨；酵母粉濃度為6 g/L時菌絲干重最高，為1.11 g/100 mL，其次是蛋白胨，在濃度為6 g/L、8 g/L、10 g/L時的菌絲干重顯著高于氮源硫酸銨。

圖2 氮源試驗菌絲干重測定結(jié)果

2.3 栽培試驗結(jié)果

2.3.1 不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)液體菌種對蛹蟲草子實體產(chǎn)量影響

由圖3可知：添加蔗糖培養(yǎng)的液體菌種的蛹蟲草產(chǎn)量顯著高于添加麥芽糖和乳糖（P＜0.05），蔗糖濃度為20 g/L和30 g/L時培養(yǎng)液體菌種的蛹蟲草產(chǎn)量顯著高于葡萄糖，蔗糖與麥芽糖培養(yǎng)液體菌種的蛹蟲草產(chǎn)量差異不顯著。

碳源為蔗糖，濃度為20 g/L培養(yǎng)液體菌種蛹蟲草產(chǎn)量最高，平均鮮重24.46 g/瓶，與蔗糖濃度為30 g/L時的蛹蟲草產(chǎn)量差異顯著。由此可知，不同碳源培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種對其子實體產(chǎn)量有很大影響，液體培養(yǎng)基中添加20 g/L蔗糖培養(yǎng)液體菌種接種栽培效果最好。

圖3 不同碳源培養(yǎng)液體菌種對蛹蟲草產(chǎn)量的影響

2.3.2 不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)液體菌種對蛹蟲草子實體產(chǎn)量影響

尿素作為氮源時沒有培養(yǎng)出液體菌種，未做栽培試驗。由圖4可見，在氮源濃度為8 g/L、10 g/L、12 g/L時，添加硫酸銨培養(yǎng)的液體菌種栽培所得蛹蟲草產(chǎn)量顯著高于酵母粉（P＜0.05）；在氮源濃度為6 g/L、10 g/L時，硫酸銨所培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草鮮重顯著高于蛋白胨（P＜0.05），以培養(yǎng)基中硫酸銨用量10 g/L培養(yǎng)菌種的蛹蟲草產(chǎn)量最高，平均鮮重達(dá)到25.6 g/瓶。無機氮有利于酵母狀細(xì)胞的合成，這可能是液體培養(yǎng)基以硫酸銨為氮源培養(yǎng)液體菌種的蛹蟲草產(chǎn)量高于蛋白胨和酵母粉的原因。

圖4 不同氮源培養(yǎng)液體菌種對蛹蟲草產(chǎn)量的影響

同一氮源不同濃度處理間蛹蟲草產(chǎn)量差異不顯著。

2.4 不同碳氮源培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草多糖含量影響

2.4.1 不同碳源培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草多糖含量

從圖5中可以看出：在碳氮源濃度為25 g/L時，以乳糖和葡萄糖作為碳源培育液體菌種的蛹蟲草子實體的多糖含量顯著高于蔗糖和麥芽糖（P＜0.05）；以葡萄糖為碳源，濃度為10 g/L時所培養(yǎng)的液體菌種培育出的蛹蟲草多糖含量最高為1.81 g/100 g，其次乳糖為碳源。

同一碳源其不同濃度蛹蟲草多糖含量差異不顯著。

圖5 不同碳源培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草多糖含量

2.4.2 不同氮源培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草多糖含量

由圖6中可以看出：在氮源濃度為12 g/L和14 g/L時，蛋白胨為氮源培養(yǎng)液體菌種的蛹蟲草多糖含量顯著高于硫酸銨和酵母粉，并且在濃度為12 g/L時蛹蟲草多糖含量最高為1.91 g/100 g?？梢娕囵B(yǎng)蛹蟲草子實體液體培養(yǎng)基中添加12 g/L的蛋白胨有利于提高蛹蟲草多糖含量。

圖6 不同氮源培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草多糖含量

3 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種最適碳源為蔗糖，葡萄糖次之，該結(jié)果與徐慶國[13]、鄒湘月等[14]最適碳源研究結(jié)果一致，說明小分子可溶性糖類更容易被蛹蟲草菌絲和細(xì)胞吸收利用，從而充分促進了菌絲生長及代謝；宋好倩等[15]試驗得出蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)的最適氮源為1%的酵母粉，其次是蛋白胨，與筆者試驗不同氮源培養(yǎng)液體菌種結(jié)果基本一致。楊宣華[16]研究得出黃豆粉作為氮源菌球數(shù)量最多，蛋白胨次之。由此可見，蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)基的氮源并不單一。

楊宣華[16]在栽培蛹蟲草培養(yǎng)基中添加蛋白胨可獲高產(chǎn)，試驗在液體菌種培養(yǎng)基中添加10 g/L硫酸銨，培養(yǎng)液體菌種接種栽培獲得高產(chǎn)。

王永敏等[17]得出以蔗糖為碳源的液體菌絲多糖得率最高，最低為乳糖；王飛等[18]在液體發(fā)酵培養(yǎng)基添加蔗糖，蛋白胨所得液體菌液多糖含量最高。試驗測定了不同碳氮源培養(yǎng)液體菌種栽培蛹蟲草子實體多糖，得出以葡萄糖作為碳源，以蛋白胨作為氮源所培養(yǎng)的液體菌種栽培蛹蟲草子實體多糖含量高。由此看出，無論是培養(yǎng)菌絲還是蛹蟲草子實體，以蛋白胨作為氮源都可以促進蛹蟲草多糖的合成。

鐘思敏[19]等得出以蛋白胨為氮源還可提高菌絲中蟲草素含量，由此可知，培養(yǎng)基添加碳氮源對蛹蟲草菌絲或子實體的有效成分的積累有著重要的影響，而試驗只測定了蛹蟲草子實體多糖，其他有效成分如蟲草素、蟲草酸等還需進一步研究。