基于雌激素受體調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路的黃芩中抗氧化成分的篩選

劉媛媛，劉 陶，吳玉梅，張 晗，趙 鑫，劉志東，李 楠

(天津中醫(yī)藥大學(xué)1. 現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心、2. 天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 301617)

隨著環(huán)境的日益惡化以及大氣層的不斷破壞，輻射地球的紫外線(ultraviolet rays，UV)強(qiáng)度越來(lái)越大。皮膚長(zhǎng)期暴露于紫外線下導(dǎo)致皮膚老化，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，氧化應(yīng)激是UV造成皮膚損傷的重要原因。當(dāng)皮膚受到UV輻射時(shí)，皮膚內(nèi)形成大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)。正常情況下，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，UV反復(fù)照射破壞了氧化和抗氧化防御系統(tǒng)平衡[1]。高水平的ROS等氧化物可引起表皮角質(zhì)層和真皮層內(nèi)細(xì)胞脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等大分子損傷，影響相關(guān)信號(hào)通路傳導(dǎo)。

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是調(diào)控細(xì)胞對(duì)抗外源性有害物質(zhì)和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，誘導(dǎo)抗氧化蛋白表達(dá)。Nrf2-ARE是機(jī)體抵抗內(nèi)外界氧化損傷的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2-3]。正常生理情況下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1結(jié)合，并處于活性相對(duì)抑制狀態(tài)。在應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與Keap1解離轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，啟動(dòng)下游超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等基因和蛋白表達(dá)，從而維持機(jī)體氧化還原平衡。Nrf2-ARE通過(guò)抑制ROS，從而阻止光老化的形成。

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)是唇形科黃芩屬多年生草本植物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效。黃芩的活性成分主要是黃酮類(lèi)，包括漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷等。漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷均具有抗氧化、抗衰老的作用[4]。植物雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)雌激素受體，促進(jìn)細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2入核[5-9]，從而發(fā)揮抗氧化抗衰老作用[2，10-12]。漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷均為黃芩中植物雌激素類(lèi)成分[12-13]，它們是否能通過(guò)雌激素受體調(diào)節(jié)Nrf2-ARE信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化作用還有待明確。本研究通過(guò)建立基于Nrf2-ARE通路的報(bào)告基因篩選模型，篩選黃芩中基于雌激素受體發(fā)揮抗氧化作用的活性成分，并利用UVB造模后的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料

1.1 儀器FORMA3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)；超凈臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程有限公司)；SH2B型紫外光療儀(美國(guó)Sigma)；DMIL倒置相差顯微鏡(德國(guó)LEICA)；Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)；VICTORTMX5多功能讀板儀(Perkin Elmer)；Flex Station3多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecula Device)。

1.2 藥物與試劑叔丁基對(duì)苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ，Sigma)；ICI 182780(Biotechne，批號(hào)：129453618)；全反式維甲酸ATRA(Solarbio，批號(hào)：1228A023)；ROS試劑盒、SOD測(cè)試盒(WST-8法)，均購(gòu)自碧云天；SOD測(cè)試盒(WST-1法)，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；漢黃芩素(wogonin，批號(hào)：C19A8Q34235)、黃芩素(baicalein，批號(hào)：C20M8Y31962)、黃芩苷(baicalin，批號(hào)：P16S8F44143)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Biological Industries)；DMSO(Sigma)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo Lab)；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、質(zhì)粒小提試劑盒(天根)；螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL4.37、海腎熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK(Promega)；氨芐西林、LB液體培養(yǎng)基(干粉)、LB固體培養(yǎng)基(干粉)，購(gòu)自Solarbio。

1.3 細(xì)胞株人腎上皮細(xì)胞系293T、人類(lèi)永生化表皮細(xì)胞株HaCaT，來(lái)源為ATCC細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證利用感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGL4.37，并加入到適量菌湯中，用無(wú)菌的涂布器取適量菌湯涂布于選擇培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，37 ℃過(guò)夜。挑取單個(gè)菌粒，加入到含有適量肉湯的錐形瓶中，37 ℃、160 r·min-1過(guò)夜搖菌。從過(guò)夜搖菌的菌液中取1 mL于離心管中，做好標(biāo)記。通過(guò)設(shè)計(jì)上游引物①：5′-GTGAATCGATAGTACTAACA-3′；上游引物②：5′-TCAACGAGTACGACTTCGTG-3′；下游引物①：5′-CCAAACTCATCAATGTATCT-3′三段引物，將質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序，以進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性克隆[5]。

2.2 質(zhì)粒的提取及測(cè)定取“2.1”中陽(yáng)性克隆的菌液，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。取1 μL質(zhì)粒溶液，以DEPC水作空白對(duì)照。在紫外分光光度計(jì)上分別讀取260 nm、280 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇293T細(xì)胞，以10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5 293T細(xì)胞瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染及ARE轉(zhuǎn)錄活性的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，以3×104個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%～80%時(shí)，使用PEI(1 g·L-1)轉(zhuǎn)染試劑同時(shí)轉(zhuǎn)染ARE熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL4.37(每孔41 ng)和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pRL-TK(每孔2.4 ng)，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，各孔分別加入Nrf2激活劑tBHQ(10 μmol·L-1)，不同濃度的黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素和細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。棄上清液，D-Hank′s漂洗細(xì)胞，裂解后，用Dual-Luciferase檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性對(duì)比，得到相對(duì)熒光素酶活性值。誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)=(藥物誘導(dǎo)的Luciferase/藥物誘導(dǎo)的Renilla)/(基培對(duì)照組的Luciferase/基培對(duì)照組的Renilla)。

2.6 黃芩主要活性成分通過(guò)雌激素受體影響Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用預(yù)先給予濃度為1 μmol·L-1的雌激素受體抑制劑ICI 182780稀釋液50 μL處理細(xì)胞1 h，再分別加入200 μmol·L-1的黃芩苷溶液50 μL，使黃芩苷最終濃度為100 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，檢測(cè)熒光，方法同“2.5”。

2.7 驗(yàn)證黃芩中主要活性成分的抗氧化作用

2.7.1細(xì)胞模型的建立 復(fù)蘇HaCaT細(xì)胞，以10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右進(jìn)行種板。抑制劑組預(yù)先給予濃度為1 μmol·L-1的雌激素受體抑制劑ICI 182780稀釋液和1 μmol·L-1Nrf2-ARE通路抑制劑ATRA[14]稀釋液各50 μL處理HaCaT細(xì)胞1 h，再分別加入200 μmol·L-1的黃芩苷溶液50 μL，使黃芩苷最終濃度為100 μmol·L-1，給藥組直接給予100 μmol·L-1的黃芩苷溶液100 μL，加入繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，造模。將預(yù)給藥后的HaCaT細(xì)胞分別給予不同劑量的UV照射，設(shè)置空白對(duì)照組，24 h后分別收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活性。光源采用美國(guó)Sigma公司的SH2B型紫外光療儀，模擬UVB輻射皮膚損傷模型，光譜為280～320 nm，強(qiáng)度為60 mJ·cm-2。

2.7.2UVB照射后HaCaT細(xì)胞ROS、SOD活性的檢測(cè) 使用ROS試劑盒考察空白組、模型組、給藥組、抑制劑組的HaCaT細(xì)胞ROS活性。用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，每孔加入100 μL稀釋好的DCFH-DA工作液，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min。用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，每孔加入100 μL MEM培養(yǎng)基。在酶標(biāo)儀中使用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm檢測(cè)熒光值。

使用SOD試劑盒考察空白組、模型組、給藥組、抑制劑組的HaCaT細(xì)胞SOD活性。ICI 182780組采用WST-8檢測(cè)法，ATRA組采用WST-1檢測(cè)法。按說(shuō)明書(shū)操作計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的驗(yàn)證及質(zhì)量的測(cè)定通過(guò)基因測(cè)序得2 098 bp，將該序列與已知質(zhì)粒進(jìn)行比對(duì)，同源性99%，其中測(cè)序序列結(jié)果中包含ARE序列，證明轉(zhuǎn)化成功。質(zhì)粒濃度為158.00 mg·L-1，純度為1.97。

3.2 黃芩主要活性成分對(duì)293T細(xì)胞活力的影響如Fig 1所示，黃芩苷(1、10、100 μmol·L-1)組293T細(xì)胞活力與正常對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性，漢黃芩素和黃芩素1 μmol·L-1組293T細(xì)胞活力與正常對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性。1、10、100 μmol·L-1為黃芩苷對(duì)293T細(xì)胞的安全濃度，1 μmol·L-1為漢黃芩素和黃芩素的安全濃度。采用黃芩苷、漢黃芩素和黃芩素的安全濃度進(jìn)行抗氧化活性的篩選。

3.3 黃芩抗氧化活性成分的篩選分別將黃芩苷(1、10、100 μmol·L-1)，漢黃芩素(0.2、0.5、1 μmol·L-1)和黃芩素(0.2、0.5、1 μmol·L-1)加入轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒DNA的293T細(xì)胞中，檢測(cè)報(bào)告基因的活性。Fig 2結(jié)果顯示，100 μmol·L-1黃芩苷可明顯激活293T細(xì)胞中的Nrf2-ARE通路，誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)為空白組的(1.56±0.01)倍(P<0.01)；黃芩苷(1、10 μmol·L-1)誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)與空白組比較差異均無(wú)顯著性。如Fig 3所示，漢黃芩素和黃芩素0.2、0.5、1 μmol·L-13個(gè)濃度的誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)均小于1，無(wú)抗氧化活性。

Fig 1 Effect of scutellarin, baicalein, baicalin on cell viability of 293T n=6)

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of baicalin on luciferase induction

**P<0.01vscontrol

Fig 3 Effect of scutellarin, baicalein on luciferase induction in 293T

A:Control;B:tBHQ;C:0.2 μmol·L-1of scutellarin;D: 0.5 μmol·L-1of scutellarin;E: 1 μmol·L-1of scutellarin;F: 0.2 μmol·L-1of baicalein;G: 0.5 μmol·L-1of baicalein;H: 1 μmol·L-1of baicalein.**P<0.01vscontrol

3.4 黃芩主要活性成分通過(guò)雌激素受體影響Nrf2-ARE通路如Fig 4所示，預(yù)給予雌激素受體特異性抑制劑ICI 182780后，誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)下降至(1.02±0.23)倍，抗氧化作用基本消失。

Fig 4 Effect of ICI 182780 on luciferase-upregulation

**P<0.01vscontrol

3.5 驗(yàn)證黃芩主要活性成分通過(guò)雌激素受體影響Nrf2-ARE通路Tab 1結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芩苷(100 μmol·L-1)對(duì)HaCaT細(xì)胞有明顯的抗氧化作用。預(yù)給予雌激素受體特異性抑制劑ICI 182780后，ROS值升高，SOD值下降，抗氧化作用消失。表明黃芩苷可能通過(guò)雌激素受體發(fā)揮抗氧化作用。

Tab 1 Regulation of baicalin on ROS and SOD levels in UVB-irradiated HaCaT cells after ICI 182780

**P<0.01vsmodel

3.6 驗(yàn)證黃芩主要活性成分通過(guò)Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用Tab 2結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芩苷(100 μmol·L-1)對(duì)HaCaT細(xì)胞有明顯的抗氧化作用。預(yù)給予Nrf2-ARE通路特異性抑制劑ATRA后，ROS值升高，SOD值下降，抗氧化作用消失。表明黃芩苷可能通過(guò)Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。

4 討論

本研究采用基因載體pGL4.37-ARE與內(nèi)對(duì)照?qǐng)?bào)告基因載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，建立雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，檢測(cè)293T細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)，并將其誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)歸一化，以消除實(shí)驗(yàn)中不同測(cè)試之間所固有的變化，從而篩選出可明顯激活293T細(xì)胞中的Nrf2-ARE通路的活性成分黃芩苷，并為后續(xù)單體抗氧化成分的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Tab 2 Regulation of baicalin on ROS and SOD levels in UVB-irradiated HaCaT cells after ATRA

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩苷可以下調(diào)Keap1表達(dá)、上調(diào)Nrf2蛋白水平，過(guò)量的Nrf2由胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與ARE調(diào)控序列結(jié)合，啟動(dòng)下游SOD等基因和蛋白表達(dá)，從而清除氧自由基[10]，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[6]。研究表明，黃芩苷(100 μmol·L-1)可緩解UVB照射所致HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的過(guò)量表達(dá)，提高SOD活性，從而達(dá)到對(duì)UVB照射導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。預(yù)加入雌激素受體抑制劑和Nrf2-ARE通路抑制劑抗氧化作用消失，從而推斷黃芩苷可能是通過(guò)雌激素受體調(diào)節(jié)Nrf2-ARE通路發(fā)揮抗氧化作用。

黃芩素與黃芩苷化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但在本研究構(gòu)建的篩選模型中，在考察濃度范圍內(nèi)黃芩素未表現(xiàn)出抗氧化作用。劉靖麗等[15]從密度泛函理論角度探討了黃芩素和黃芩苷抗氧化活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系，認(rèn)為C6位的酚羥基是黃芩苷黃芩素的最大反應(yīng)活性位點(diǎn)。在非極性溶劑中，抗氧化活性取決于脫氫能力，脫氫能力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)，黃芩苷的脫氫能力強(qiáng)于黃芩素，所以黃芩苷的抗氧化活性大于黃芩素；在極性溶劑中，抗氧化活性取決于電離勢(shì)，電離勢(shì)越低，抗氧化活性越強(qiáng)，黃芩苷的電離勢(shì)低于黃芩素，所以黃芩苷的抗氧化活性強(qiáng)于黃芩素。與本研究結(jié)果一致。

本研究成功建立了雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，用于體外篩選具有抗氧化活性成分，并用UVB造模后的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩中主要活性成分黃芩苷通過(guò)雌激素受體影響Nrf2-ARE通路，發(fā)揮抗氧化作用。