用自制單克隆抗體建立檢測(cè)NGAL的膠體金方法

郭會(huì)燦 李君華 武曉莉 張麗媛 徐冬梅

(石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050000)

人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)，是Lipocalin 家族的成員，NGAL發(fā)現(xiàn)于中性粒細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶的陰性顆粒中[1]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在人體盲腸、胃、子宮、唾液腺等多種組織器官中的表達(dá)都很穩(wěn)定。研究顯示，NGAL參與了炎癥、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，并與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，NGAL在急性腎損傷早期的患者尿液中含量會(huì)迅速升高，因此作為新型腎損傷標(biāo)志物受到廣泛的關(guān)注[2]。國(guó)內(nèi)外醫(yī)院和生物醫(yī)藥公司對(duì)NGAL診斷研究正處在白熱化階段，雖然有部分公司已經(jīng)取得一定成果，但多數(shù)停留在臨床研究階段。目前只有丹麥BioPorto公司生產(chǎn)的NGAL試劑盒通過(guò)了歐盟認(rèn)證并批準(zhǔn)生產(chǎn)銷售[3]。國(guó)外進(jìn)口NGAL檢測(cè)試劑盒在價(jià)格上必然昂貴，一方面給患者增加了診療成本，同時(shí)也限制了該項(xiàng)檢測(cè)在臨床上的普及和應(yīng)用。隨著即時(shí)檢測(cè)(POCT)[4]和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的飛速發(fā)展[5]，這些技術(shù)以高特異、高靈敏度的抗體原料為基礎(chǔ)，成為醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱門方向。本文制備了高靈敏度、高特異性的NGAL單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上初步建立了NGAL免疫膠體金層析試紙條檢測(cè)方法，為臨床早期腎損傷診斷提供了快速、便捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 弗氏佐劑(包括完全和不完全)、抗體亞型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；硝酸纖維素膜、PVC板、玻璃纖維膜、吸水墊等購(gòu)自MILLI-PORE；HRP羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋；重組人NGAL(rhNGAL)為本實(shí)驗(yàn)室自表達(dá)；其他化學(xué)試劑為分析純；BALB/c小鼠由本實(shí)驗(yàn)室飼喂；S/P20小鼠骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.1.2臨床樣本 臨床樣本為患者尿液，來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科門診，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)后的已知結(jié)果樣本。

1.2方法

1.2.1NGAL單克隆抗體的制備[6]選用5只BALB/c小鼠，采用背部多點(diǎn)免疫的方法，首次采用弗氏完全佐劑進(jìn)行免疫，以后每2周采用弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫。通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)有限稀釋法篩選特異性抗NGAL單克隆抗體。將建株細(xì)胞混合石蠟注入小鼠腹腔，誘生腹水獲得大量單一的單克隆抗體。經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和Protein A柱兩步驟對(duì)抗體進(jìn)行純化即得到純化的NGAL單克隆抗體，分別采用Sigma的亞型試劑盒對(duì)抗體進(jìn)行亞型測(cè)定，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，雙抗夾心法進(jìn)行配對(duì)測(cè)定。

1.2.2金標(biāo)NGAL抗體的制備 在離心管中加入10 ml 膠體金溶液，再加入0.1 mg抗NGAL單克隆抗體，振蕩混勻后調(diào)pH至8.8，在室溫下攪拌1 h，用0.1%BSA溶液作為封閉液，繼續(xù)攪拌1 h，將上述溶液用超低溫離心機(jī)4℃下8 000 r/min離心30 min，保留下層沉淀，用1 ml pH7.5的10 mmol/L的磷酸緩沖液(含0.3%PC300、0.5%BSA%、2%蔗糖)重懸即得金標(biāo)NGAL抗體溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3金標(biāo)NGAL抗體偶聯(lián)物的質(zhì)量鑒定

1.2.3.1紫外-可見分光光度計(jì)鑒定 在400～600 nm 的可見范圍內(nèi)，用紫外-可見分光光度計(jì)分別對(duì)金標(biāo)NGAL抗體偶聯(lián)物和膠體金粒子進(jìn)行掃描，由于抗體表面會(huì)吸附膠體金粒子，體積變大，如果偶聯(lián)成功，在最大吸收波長(zhǎng)及峰形上膠體金粒子會(huì)有變化，也就能驗(yàn)證金標(biāo)NGAL抗體偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功。

1.2.3.2透射電鏡鑒定 通過(guò)透射電鏡對(duì)金標(biāo)NGAL抗體偶聯(lián)物及膠體金粒子進(jìn)行粒徑測(cè)定，在電鏡相同縮放比例下，查看兩者的粒徑和顆粒表面的變化情況，來(lái)判斷是否偶聯(lián)成功。

1.2.3.3試紙條鑒定 將羊抗鼠的二抗1∶10稀釋，以10.0 μl的量分別在NC膜上劃線，并標(biāo)記位置，將其在干燥箱靜置干燥。分別在劃線處滴加金標(biāo)NGAL抗體(1∶10稀釋)及0.01 mol/L 磷酸緩沖液(作為陰性對(duì)照)，5 min后觀察試驗(yàn)結(jié)果。若在滴加金標(biāo)NGAL抗體的劃線處出現(xiàn)明顯的紅色線條，且滴加磷酸緩沖液的劃線處為無(wú)色，則表明金標(biāo)NGAL抗體具有活性；若劃線處均不顯色，則表明金標(biāo)NGAL抗體失活或沒有偶聯(lián)成功。

1.2.4NGAL膠體金試紙條的制備 將結(jié)合墊預(yù)先處理后備用，用移液器吸取金標(biāo)NGAL抗體，均勻涂布在結(jié)合墊上，干燥即得；適量的羊抗鼠IgG和配對(duì)的抗NGAL抗體用劃膜儀分別噴涂在NC膜(30 cm×2.5 cm)上，作為C線質(zhì)控線和T線檢測(cè)線，干燥備用。NGAL膠體金試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水墊按圖1所示的順序組裝而成。

1.2.5NGAL膠體金試紙條的檢測(cè)方法 吸取待檢樣品100 μl，滴在加樣孔內(nèi)，待檢樣品基于層析原理，會(huì)由樣品墊依次經(jīng)過(guò)結(jié)合墊、NC膜(檢測(cè)線、質(zhì)控線)到達(dá)吸水區(qū)。檢測(cè)時(shí)間僅為5 min，即可顯示結(jié)果。

若待檢樣品中含有NGAL，先與吸水墊上的金標(biāo)NGAL抗體偶聯(lián)物結(jié)合，層析至NC膜后，與包被在檢測(cè)線處的NGAL單克隆抗體結(jié)合形成NGAL單克隆抗體-NGAL抗原-金標(biāo)NGAL抗體復(fù)合物，形成紅色可見條帶。結(jié)果判定方法：C線和T線均顯色，判為陽(yáng)性；C線顯色，T線不顯色，判為陰性；T線顯色，C線不顯色或C、T線均不顯色，判為無(wú)效。

1.2.6NGAL膠體金試紙條的性能測(cè)定

1.2.6.1靈敏度試驗(yàn) 將1 mg/ml的rhNGAL貯備液稀釋成下列10個(gè)濃度梯度，分別為0、2、3、4、5、6、8、10、25、50 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別用制備好的NGAL試紙條按1.2.5所述的檢測(cè)方法對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度測(cè)試3次，共測(cè)試3個(gè)批次的NGAL試紙條。

1.2.6.2重復(fù)性試驗(yàn) 分別配制成為陰性、5 ng/ml、50 ng/ml的NGAL標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度測(cè)試10條，共抽取3批進(jìn)行測(cè)試。

1.2.6.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 將上述制備好的NGAL試紙條同干燥劑一起用鋁箔袋塑封，在鋁箔袋上標(biāo)注生產(chǎn)日期，進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。分別貯存在4℃、室溫、37℃三種保存條件下，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。其中4℃、室溫貯存的NGAL膠體金試紙條每月檢測(cè)一次，37℃貯存的NGAL膠體金試紙條每天檢測(cè)一次，分別對(duì)陰性樣本和5、10 ng/ml陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)試，觀察穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果。

圖1 試紙條組成示意圖Fig.1 Diagram of paper strip composition

1.2.6.4臨床樣本的檢測(cè) 使用制作好的NGAL膠體金試紙條對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，臨床樣本包括30份陽(yáng)性患者樣本和20份正常體檢者樣本，記錄編號(hào)后，打亂順序，進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與臨床結(jié)果進(jìn)行比較，通過(guò)兩者結(jié)果的一致率來(lái)判斷自制的NGAL膠體金試紙條的臨床應(yīng)用性能。

2 結(jié)果

2.1NGAL單克隆抗體鑒定 本研究獲得5株能分泌NGAL單克隆抗體的細(xì)胞株，通過(guò)雙抗夾心ELISA對(duì)分泌的單克隆抗體進(jìn)行兩兩抗體配對(duì)，最后篩選出1B4、2C6兩株分泌的單克隆抗體配對(duì)成功。間接ELISA測(cè)定1B4效價(jià)為1∶1.02×106、親和力達(dá)到2×108，亞型為IgG1；2C6效價(jià)為1∶5.12×105，親和力達(dá)到4×108，亞型為IgM。

圖2 膠體金溶液400～600 nm掃描圖譜Fig.2 Scanning map of colloidal gold solution at 400-600 nm

圖3 金標(biāo)NGAL抗體2C6偶聯(lián)物400～600 nm掃描圖譜Fig.3 Scanning map of anti-NGAL antibody 2C6 conjugate with colloidal gold at 400-600 nm

2.2金標(biāo)NGAL抗體2C6偶聯(lián)物的質(zhì)量鑒定

2.2.1紫外-可見分光光度儀鑒定結(jié)果 圖2、圖3分別為膠體金粒子和金標(biāo)NGAL抗體2C6偶聯(lián)物在400～600 nm波段內(nèi)經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)掃描的結(jié)果，膠體金粒子最大吸收波長(zhǎng)為526.0 nm；金標(biāo)NGAL抗體2C6偶聯(lián)物最大吸收波長(zhǎng)為536.0 nm。由此看出膠體金標(biāo)記NGAL抗體后粒徑增大，且最大波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移，證明偶聯(lián)成功。

2.2.2透射電鏡法鑒定結(jié)果 經(jīng)過(guò)電鏡觀察，圖4為膠體金粒子透射電鏡結(jié)果，顆粒大小均勻圓潤(rùn)，圖5為金標(biāo)NGAL抗體2C6偶聯(lián)物透射電鏡結(jié)果，顆粒變大且邊緣出現(xiàn)不規(guī)則絮狀物，由此表明抗NGAL單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)成功。

圖4 膠體金透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron microscopy of colloidal gold

圖5 金標(biāo)NGAL抗體2C6偶聯(lián)物透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopy of anti-NGAL antibody 2C6 conjugate with colloidal gold

2.2.3試紙條法鑒定結(jié)果 試紙條檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，在羊抗鼠二抗點(diǎn)樣處，加入金標(biāo)NGAL抗體的出現(xiàn)了紅色條帶，陰性對(duì)照則無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，證明抗NGAL單克隆抗體與膠體金的偶聯(lián)物具有活性。

2.3優(yōu)化NGAL膠體金試紙條 本研究通過(guò)兩兩配對(duì)的雙抗夾心試驗(yàn)，篩選出1B4、2C6兩個(gè)抗體配對(duì)，通過(guò)棋盤法確定兩配對(duì)抗NGAL抗體的最佳工作濃度。1B4的包被濃度為0.25、0.5、1.0 1 mg/ml，金標(biāo)抗體2C6的稀釋濃度為1∶5、1∶10、1∶15。如圖7所示，金標(biāo)NGAL抗體2C6的稀釋濃度為1∶5，1B4包被濃度為0.5 mg/ml這個(gè)組合，提供了低的cut-off值、低的抗體用量、深的檢測(cè)線和清晰的背景，因此篩選金標(biāo)抗體1∶5和包被抗體濃度0.5 mg/ml 的稀釋比例作為最佳反應(yīng)組合來(lái)制備NGAL試紙條。

2.4NGAL膠體金試紙條的性能測(cè)定

2.4.1靈敏度試驗(yàn) 3批次NGAL試紙條重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果一致，如表1所示，樣本中NGAL含量在5 ng/ml 及以上時(shí)，結(jié)果測(cè)試均為陽(yáng)性。樣本中NGAL含量為4 ng/ml時(shí)，T檢測(cè)線較C質(zhì)控線顏色變淺，沒有完全消失但肉眼分辨不清楚，無(wú)法明確判定結(jié)果。樣本中NGAL含量低于4 ng/ml時(shí)，檢測(cè)線基本消失，肉眼很難分辨，測(cè)試結(jié)果均為陰性。經(jīng)對(duì)不同批次進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果基本一致，由此確定本NGAL試紙條的檢測(cè)限為5 ng/ml。

圖6 試紙條鑒定結(jié)果Fig.6 Test strip identification resultsNote: A.Anti-NGAL antibody 2C6 conjugate with colloidal gold was added；B.Negative control.

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn) 由表2可知，NGAL濃度為5 ng/ml、50 ng/ml的樣本，重復(fù)10次的結(jié)果保持一致，均為陽(yáng)性；陰性樣本重復(fù)10次檢測(cè)的結(jié)果保持一致，均為陰性；由此試驗(yàn)說(shuō)明NGAL試紙條在批間和批內(nèi)的重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 在4℃、室溫保存的試紙條，追蹤一年的測(cè)試中，檢測(cè)陰性樣本的質(zhì)控線清晰，檢測(cè)線沒有出現(xiàn)，且背景干凈；檢測(cè)5 ng/ml和10 ng/ml 的NGAL陽(yáng)性樣本時(shí)，T檢測(cè)線和C質(zhì)控線顏色深淺一致，并沒有因?yàn)楸４鏁r(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)顏色變淺的現(xiàn)象，并與對(duì)照試紙條比較顏色沒有變?nèi)?，說(shuō)明試紙條在4℃、室溫下可以保存1年的有效期。NGAL試紙條在37℃條件下，前6 d，T檢測(cè)線和C質(zhì)控線顏色深淺一致，且與對(duì)照NGAL試紙條比較，顏色沒有變?nèi)?，檢測(cè)到第7天時(shí)，T檢測(cè)線相對(duì)于對(duì)照NGAL試紙條的T檢測(cè)線開始變淺，得出試紙條有效期1年。

2.4.4臨床樣本的檢測(cè) 通過(guò)對(duì)自制的NGAL膠體金試紙條對(duì)50份臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果比對(duì)分析，檢出30份陽(yáng)性樣本和20份陰性樣本，且結(jié)果符合率100%。說(shuō)明本研究制備的NGAL膠體金試紙條的準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，該試紙條在準(zhǔn)確度、 靈敏度和穩(wěn)定性上能與市售成熟的試劑盒相媲美，應(yīng)用前景廣闊。

圖7 NGAL抗體最佳稀釋濃度組合篩選Fig.7 Optimal dilution concentration combination screening of NGAL antibody

表1 試紙條靈敏度測(cè)定Tab.1 Sensitivity determination of strip

表2 試紙條重復(fù)性測(cè)定Tab.2 Repeatability determination of strip

3 討論

經(jīng)研究顯示，NGAL作為L(zhǎng)ipocalin家族的一個(gè)新成員，不但組織分布廣，還參與多種病理、生理過(guò)程。Nielsen等[7]對(duì)兒童和成人的心臟手術(shù)后前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后2～6 h，在病人的血液和尿液中就能檢測(cè)到濃度高于正常值10倍以上的NGAL，Mishra等[8]也通過(guò)研究得出急性腎損傷之后，在早期尿NGAL會(huì)急速上升，證明了NGAL是心臟手術(shù)后急性腎損傷的早期跡象。2011年Hinze等[9]利用ROC曲線對(duì)NGAL預(yù)測(cè)AKI進(jìn)行了探討，其中曲線下的面積為0.78，敏感性76%，特異性80%，得出了NGAL可以在不聯(lián)合肌酐檢測(cè)的情況下，獨(dú)立預(yù)測(cè)亞臨床的AKI。2013年最新研究發(fā)現(xiàn)NGAL同IL-18、MA、NAG、αl-MG及UCr相比，是預(yù)測(cè)搭橋后急性腎損傷的最佳分子，可以更早發(fā)現(xiàn)腎臟損傷，為臨床治療腎臟損傷提供參考價(jià)值[10]。

而本研究研制的NGAL膠體金試紙條，靈敏度高，檢測(cè)限為5 ng/ml，與何瑩等[11]建立的雙抗夾心ELISA免疫檢測(cè)方法的靈敏度4.8 ng/ml基本一致，但本研究的NGAL試紙條檢測(cè)時(shí)間短，且成本低，重復(fù)性、特異性、穩(wěn)定性好，保存期長(zhǎng)達(dá)一年，能夠滿足臨床應(yīng)用要求，應(yīng)用前景廣闊。