電針足三里對坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達(dá)的影響

李瑜芝 ，余文英 ，吳倩雯 ，黃 華 ，林麗莉

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122；2.澳大利亞悉尼北京同仁堂中醫(yī)診所，澳大利亞 悉尼 2000）

神經(jīng)病理性疼痛是軀體感覺系統(tǒng)損害或疾病導(dǎo)致的疼痛，主要臨床表現(xiàn)為自發(fā)痛，不同患者疼痛性質(zhì)不全相同，以牽扯樣痛、電擊樣痛、針刺樣痛、撕裂樣痛、燒灼樣痛、重壓性痛、膨脹樣痛及麻木樣痛較多見，發(fā)病機(jī)制主要在于外周敏化、中樞敏化及離子通道改變［1］。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）為絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）的重要家族成員之一［2］，其參與多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)，在疼痛性傷害性刺激引起的外周及中樞神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、離子通道等變化中發(fā)揮重要作用。研究已經(jīng)表明在多種疼痛模型中脊髓背角磷酸化ERK1／2被激活，表達(dá)顯著升高，提示活化的ERK1／2可能參與疼痛的維持和痛覺的神經(jīng)敏化［3-5］。針刺鎮(zhèn)痛歷史悠久，療效顯著，電針是在傳統(tǒng)針刺的基礎(chǔ)上加入一定參數(shù)的電流進(jìn)行脈沖刺激以增強(qiáng)療效的現(xiàn)代療法，其鎮(zhèn)痛作用明確［6］。針刺足三里具有良好的鎮(zhèn)痛效果，尤其體現(xiàn)在神經(jīng)病理性疼痛、炎性痛和癌癥痛等［7-8］。本研究旨在通過觀察電針足三里穴對慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達(dá)的影響，探討電針足三里穴鎮(zhèn)痛可能的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠24只，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，體質(zhì)量 220～280 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，室溫保持在（25±2）℃，光照周期 12／12 h。

1.2 實驗試劑與儀器 雙極針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州針灸用品有限公司）；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司）；4-0絡(luò)制腸線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）；ERK1／2一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；β-action一抗（美國 CST 公司）；HRP 鼠抗兔IgG二抗（南京諾維贊生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 熱痛閾值測定 將大鼠置于黑色布袋中，頭部在前，待測尾部露出布袋外，待動物安靜后進(jìn)行熱痛閾值測量。在布套束縛限制運(yùn)動的條件下，用50℃的熱水浸燙大鼠尾部中下三分之一，以其甩尾時間閾值作為測痛指標(biāo)，用秒表計時。每只測試3次，每次間隔5 min，取3次平均值，測試時間為上午8～12時。所有實驗大鼠在入組前均接受熱痛閾測定，熱痛閾值小于2 s或者大于10 s者表示動物反應(yīng)過敏或者遲鈍，為痛覺異常大鼠，不納入試驗對象。

2.2 分組與造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行熱痛閾篩選，采用隨機(jī)數(shù)表法將SD大鼠分為空白組、模型組、電針后即刻組、電針后0.5 h組，每組各6只。模型組、電針后即刻組和電針后0.5 h組參照文獻(xiàn)［9］中的造模方法：手術(shù)前一天禁食不禁水，用10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔注射，麻醉成功后，備皮、消毒、鋪無菌巾，剪開術(shù)區(qū)皮膚約2 cm，鈍性分離肌肉，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)中段，用4-0的鉻制腸線給予疏松單結(jié)結(jié)扎4次，1 mm間隔，松緊度以不影響坐骨神經(jīng)血液循環(huán)和右后肢肌肉出現(xiàn)輕微抖動為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)扎線可以在坐骨神經(jīng)主干上滑動，在切口處敷青霉素鈉鹽粉預(yù)防感染，縫合皮膚。手術(shù)后，每3只大鼠為一籠飼養(yǎng)，麻醉清醒后自由攝取水和食物，密切觀察生命體征和傷口愈合情況。

2.3 干預(yù) 將電針后即刻組和電針后30 min組大鼠固定于特制鼠籠中，使之頭尾稍可活動，但身體不能轉(zhuǎn)動，于造模后第7天開始進(jìn)行雙側(cè)足三里穴電針治療，參照《實驗針灸學(xué)》［10］定位雙側(cè)足三里穴，約在大鼠腓骨小頭下方約5 mm處，選用雙極針配合韓式電針儀治療，參數(shù)為：疏密波，2 Hz，輸出電流1 mA。留針20 min，強(qiáng)度以大鼠肢體輕微顫動，但不出現(xiàn)掙扎為準(zhǔn)?？瞻捉M和模型組大鼠固定于特制鼠籠，使之頭尾稍可活動，但身體不能轉(zhuǎn)動，固定20 min。

2.4 取材 空白組和模型組固定20 min后即刻取材，電針即刻組和電針后30 min組分別于電針后即刻和30 min后取材。以10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔麻醉，腹腔面朝上固定，打開胸腔，暴露心臟。灌注用針頭自左心室插入主動脈，固定針頭，剪開右心耳。用吊泵快速注入0.9%NaCl溶液沖洗血管，剪開大鼠背部正中線皮膚，分離脊柱兩側(cè)肌肉，暴露出胸、腰、骶段脊柱，先游離坐骨神經(jīng)至椎管處，再剪開椎板暴露脊髓，用玻璃分離針挑開脊膜，最后迅速將脊髓剪下，截取脊髓腰膨大（L4～L6節(jié)段脊髓），迅速丟入液氮中，待取材完畢后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱備用。

2.5 觀察指標(biāo)及方法

2.5.1 熱痛閾值 檢測4組大鼠造模前后及干預(yù)后熱痛閾值。

2.5.2 Western blot法檢測ERK1／2蛋白的表達(dá)提取脊髓組織總蛋白后，采用BCA蛋白定量法定量，取30 μg蛋白為上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將表達(dá)產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。在Western封閉液中封閉1～2 h，經(jīng)TBST緩沖液清洗后分別加入一抗 ERK（1∶7 000）、β-actin（1∶1 000）孵育，4 ℃搖床過夜。TBST緩沖液清洗后加入二抗，室溫孵育1.5 h。TBST再次清洗，于超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像顯影，采用Bio-Rad圖像分析軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 4組大鼠熱痛閾值比較 見表1。

表1 4組大鼠熱痛閾值比較（x±s）s

3.2 4組大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達(dá)比較見圖1。

圖1 4組大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達(dá)比較

4 討 論

脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，當(dāng)外周神經(jīng)受到卡壓、損傷或者炎性物質(zhì)刺激時，傷害性信號經(jīng)神經(jīng)節(jié)初步濾過后向上傳至脊髓的背角感覺神經(jīng)元，從而引起痛覺［11］。神經(jīng)性病理性疼痛是難治療的痛癥，目前已有較多相關(guān)研究，但在臨床上仍然相當(dāng)棘手，鎮(zhèn)痛藥物的使用難免給患者帶來抑郁、煩躁等不適。研究表明神經(jīng)性病理性疼痛動物模型中脊髓背角ERK1／2的表達(dá)顯著升高，ERK1／2活性的變化與CCI導(dǎo)致的痛覺過敏有關(guān)，這充分說明ERK1／2蛋白可能參與神經(jīng)性病理性疼痛的發(fā)生與維持［12-14］。同時有學(xué)者通過提前給予疼痛大鼠髓內(nèi)注射ERK1／2抑制劑，發(fā)現(xiàn)其疼痛可以大幅度地減輕［15］。本課題通過免疫印跡技術(shù)的測定也觀察到CCI模型大鼠的ERK1／2蛋白表達(dá)較空白組顯著升高。

《勝玉歌》云：“兩膝無端腫如斗，膝眼三里艾當(dāng)施?！薄断胭x》亦云：“腳痛膝腫針三里?！薄鹅`樞·四時氣》曰：“著痹不去，……率取其三里?！薄夺樉拇蟪伞分姓J(rèn)為足三里能治療腰腿痛。《通玄指要賦》中亦可見“三里卻五勞之羸瘦；痹腎敗，取足陽明之上”的表述，《馬丹陽十二穴歌》云：“三里膝眼下，三寸兩筋間。能通心腹脹，……腿腫膝腔酸?！弊阋宰C明古代已經(jīng)明確足三里治療腰腿疼痛的重要功效，且足三里穴深層為腓深神經(jīng)，這些神經(jīng)正是坐骨神經(jīng)的分支部分。研究應(yīng)用針刺合谷、三陰交和足三里觀察產(chǎn)婦鎮(zhèn)痛的效果，結(jié)果提示足三里穴可以很好發(fā)揮鎮(zhèn)痛的功效。李思思等［16］通過觀察電針“足三里”“陽陵泉”穴對坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠脊髓背角酪氨酸激酶B受體的影響，認(rèn)為電針足三里穴可能是通過減少大鼠脊髓中 TrkB受體的表達(dá)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。喬麗娜等［17］研究認(rèn)為支配足三里穴傳入纖維的胞體主要位于L3～S1，不僅說明了針刺具有神經(jīng)階段性的鎮(zhèn)痛，也符合現(xiàn)代神經(jīng)解剖學(xué)和生理學(xué)理論遠(yuǎn)節(jié)段取穴和傳統(tǒng)針刺遠(yuǎn)端取穴的原則。大量現(xiàn)代研究表明，足三里穴具有鎮(zhèn)痛功效，尤其是對神經(jīng)病理性疼痛和炎性痛有良好的效果，電針足三里穴可以明顯緩解神經(jīng)病理性疼痛［18-20］。

針刺療法是祖國醫(yī)學(xué)的重要外治法之一，體表細(xì)胞受到針刺機(jī)械刺激后，可引起某些蛋白或酶類物質(zhì)活性的改變而導(dǎo)致一些瞬時效應(yīng)，激活和啟動其血管和神經(jīng)的相關(guān)功能，以達(dá)鎮(zhèn)痛的目的。而電針療法是在傳統(tǒng)針刺療法基礎(chǔ)上配合相應(yīng)參數(shù)的電流與脈沖的一種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)療法，研究發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)痛機(jī)制十分復(fù)雜，其中在外周中樞脊髓的鎮(zhèn)痛機(jī)制主要表現(xiàn)為抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化［21］，抑制突觸的可塑性［22］，調(diào)控脊髓 NOS 的功能［23］，抑制興奮遞質(zhì)的釋放［24］，調(diào)節(jié)抗炎因子和促炎因子以及P2X受體的表達(dá)［25-26］。有研究表明電針通過抑制ERK1／2蛋白的表達(dá)來緩解神經(jīng)性病理性疼痛［27-28］，但是從不同針刺時間的角度研究電針對脊髓背角ERK1／2蛋白的表達(dá)情況以研究其電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)尚未見明確的報道。

本研究結(jié)果顯示，電針足三里0.5 h后可提高CCI大鼠熱痛閾水平，同時下調(diào)脊髓背角ERK1／2蛋白的表達(dá)，提示電針后0.5 h組通過可能抑制CCI模型大鼠ERK1／2蛋白水平的表達(dá)從而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。相反，電針后即刻組ERK1／2蛋白水平稍高于模型組，可能是由于剛剛電針完的大鼠處于一種應(yīng)激的狀態(tài)而誘發(fā)了ERK1／2的活化。今后可進(jìn)一步延長電針干預(yù)后時間進(jìn)一步跟蹤ERK1／2的表達(dá)，以更加明確電針抑制ERK1／2蛋白水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，甚至進(jìn)一步探討電針后效應(yīng)的特點(diǎn)。

綜上所述，CCI模型可致大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白的活化，使其表達(dá)增加，經(jīng)電針足三里穴0.5 h后可以降低脊髓背角ERK1／2蛋白的表達(dá)水平，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。