抵當(dāng)湯減鉤吻毒性的實(shí)驗(yàn)研究

林慧敏 ，王婉瑩 ，王文義 ，廖華軍 ，李德森 ，吳水生

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

鉤吻［Gelsemium elegans （Gardn.et Champ.） Benth.］又名斷腸草、野葛、大茶藥等，為馬錢(qián)科胡蔓藤屬植物，是世界著名的有毒植物。中醫(yī)對(duì)其早有記載與應(yīng)用，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為下品，主金瘡、乳痓、中惡風(fēng)、咳逆上氣、水腫、殺鬼疰蠱毒?，F(xiàn)代研究表明鉤吻具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)造血等作用，特別在無(wú)成癮性鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)［1］。但鉤吻的毒性較大，且其治療量和中毒量非常接近，安全指數(shù)小，劑量不易控制，容易發(fā)生中毒反應(yīng)，每年均不乏鉤吻中毒的臨床報(bào)道［2］，限制其臨床的廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)多種途徑探索降低鉤吻不良反應(yīng)的方法，均未從根本上解決鉤吻的毒性問(wèn)題［3-5］。中醫(yī)對(duì)中藥的毒性研究歷史悠久，積累了許多寶貴經(jīng)驗(yàn)，其中應(yīng)用方劑的藥物配伍佐制是藥物減毒增（存）效的有效方法之一。抵當(dāng)湯是《傷寒論》中治療太陽(yáng)蓄血證的良方，因此我們嘗試應(yīng)用抵當(dāng)湯中藥物的配伍佐制作用，通過(guò)小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察抵當(dāng)湯是否對(duì)鉤吻具有減毒作用。結(jié)合課題組前期研究的羊血血清、血漿及血細(xì)胞對(duì)鉤吻減毒效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)羊血血漿具有減毒效應(yīng)，而血清及血細(xì)胞無(wú)此功能；且鉤吻中毒后表現(xiàn)為呼吸減慢直至衰竭，靶器官在肺，故初步選擇觀察肺組織，以期了解鉤吻中毒與抵當(dāng)湯解毒機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康昆明種6～8周齡小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 試藥 鉤吻采自福建省龍巖市胡蔓藤種植基地；抵當(dāng)湯（水蛭、大黃、虻蟲(chóng)、桃仁）購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂醫(yī)院，均經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃澤豪老師鑒定。

1.3 儀器 FA20004N電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WD-3000全自動(dòng)血液分析儀（吉林維爾醫(yī)療器械有限公司）；KH-Q2016組織切片機(jī)（闊海醫(yī)療科技有限公司）；FY135中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 藥物制備

2.1.1 鉤吻提取液的制備 參照本課題組前期的提取方法［6-7］：稱(chēng)取同一植株鉤吻粗粉適量，用5倍量的90%乙醇浸泡0.5 h，加熱回流提取2次，每次1 h，過(guò)濾，收集2次提取液，減壓濃縮回收乙醇，至無(wú)醇味后，定容得到含生藥量為0.3 g／mL的鉤吻提取液，于4℃冷藏備用。

2.1.2 抵當(dāng)湯醇提液的制備

2.1.2.1 抵當(dāng)湯各藥材的提取 ① 大黃的提?。簠⒖嘉墨I(xiàn)［8］，稱(chēng)取16 g大黃粉末，用5倍量的95%乙醇，加熱回流提取3次，第1次2 h，第2、3次1.5 h，過(guò)濾，合并3次提取液，減壓濃縮回收乙醇，至無(wú)醇味后，定容至1 g／mL，于4℃冷藏備用。② 桃仁的提取：參考文獻(xiàn)［9］，稱(chēng)取桃仁飲片 2 g，加 6倍量水，水沸騰后，煎煮2次，每次30 min，過(guò)濾，合并2次提取液，減壓濃縮，定容至 1 g／mL，于 4℃冷藏備用。③ 水蛭的提取：參考文獻(xiàn)［10-11］，稱(chēng)取16 g水蛭，用10倍量70%乙醇浸泡4 h，第1次回流提取2 h，第2、3次用8倍量的70%乙醇回流提取1.5 h，過(guò)濾，收集3次提取液，減壓濃縮回收乙醇，至無(wú)醇味后，定容至1 g／mL，于4℃冷藏備用。④虻蟲(chóng)的提?。簠⒖嘉墨I(xiàn)［12］，稱(chēng)取已去翅足的虻蟲(chóng)1 g，先用30倍量的95%乙醇脫水2 h，過(guò)濾，再用30倍量的丙酮脫脂2 h，將已脫水脫脂的虻蟲(chóng)放置過(guò)夜，干燥研磨，于30倍量的0.01 mol／L鹽水中，浸泡12 h連續(xù)3次，過(guò)濾，收集3次浸液，減壓濃縮，定容至1 g／mL，于4℃冷藏備用。

2.1.2.2 醇提液的制備 抵當(dāng)湯組成：大黃三兩，水蛭三十個(gè)，虻蟲(chóng)（去翅足）三十個(gè)，桃仁二十個(gè)，參考《傷寒論》原方的一次給藥量換算劑量為：大黃16 g，桃仁 2 g，水蛭 16 g，虻蟲(chóng) 1 g［13］。將上述大黃、桃仁、水蛭、虻蟲(chóng)的提取液按全方的比例準(zhǔn)確量取，均勻混合，濃縮至3.5 g／mL，于4℃冷藏備用。

2.1.3 抵當(dāng)湯水提液制備 按照傳統(tǒng)方法將抵當(dāng)湯四種藥材（劑量如“2.1.2.2”）加1 L純水混合浸泡0.5 h，大火煮開(kāi)，小火熬至藥液 3／5，去渣，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀按40∶1比例蒸發(fā)濃縮至3.5 g／mL，于4℃冷藏備用。

2.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 中毒死亡的判定 參見(jiàn)文獻(xiàn)［14］，小鼠灌服小劑量的鉤吻提取液3～4 min后，其主要表現(xiàn)為安靜、發(fā)抖、四肢無(wú)力及運(yùn)動(dòng)失調(diào)，呼吸減慢而有間歇，40 min之后基本恢復(fù)正常。小鼠灌服大劑量的鉤吻提取液3～4 min后，其表現(xiàn)與上所述情況一致，但時(shí)間很短暫，隨即轉(zhuǎn)向興奮狀態(tài)，叩牙頻繁，并伴有痙攣，到后期痙攣強(qiáng)度更大，繼而間歇性驚厥、跳躍，出現(xiàn)全身性劇烈的強(qiáng)直性驚厥，最后呼吸衰竭而死亡［14］。

2.2.2 急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) 取小鼠12只，隨機(jī)分成3組，每組 4只，禁食 24 h，自由飲水，分別按 1.5、1.2、1 g／kg的劑量予鉤吻提取液灌胃，觀察并記錄小鼠24 h內(nèi)的中毒癥狀和死亡情況，確認(rèn)引起100%（Dm）死亡率的劑量。

2.2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 將72只小鼠隨機(jī)分成9組，鉤吻組（給藥劑量為預(yù)試Dm劑量，下同）、抵當(dāng)湯水提液組、抵當(dāng)湯醇提液組、先鉤吻后抵當(dāng)湯水提液組、先抵當(dāng)湯水提液后鉤吻組、鉤吻與抵當(dāng)湯水提液混合組、先鉤吻后抵當(dāng)湯醇提液組、先抵當(dāng)湯醇提液后鉤吻組、鉤吻與抵當(dāng)湯醇提液混合組，每組8只，用苦味酸標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h，然后各組小鼠按照“2.2.2”中計(jì)算所得的劑量進(jìn)行一次性灌胃給藥，觀察并記錄小鼠24 h內(nèi)的中毒癥狀和死亡情況。

2.3 鉤吻配伍抵當(dāng)湯對(duì)小鼠血液、肺組織的影響

2.3.1 分組干預(yù) 將40只小鼠隨機(jī)分成5組，空白組、鉤吻組、抵當(dāng)湯醇提液組、先鉤吻后抵當(dāng)湯醇提液組、鉤吻與抵當(dāng)湯醇提液混合組，每組8只，用苦味酸標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h，然后各組小鼠按“2.2.2”方法進(jìn)行一次性灌胃給藥。小鼠出現(xiàn)中毒癥狀時(shí)眼球后靜脈叢取血，未出現(xiàn)中毒癥狀的小鼠給藥后10 min內(nèi)眼球后靜脈叢取血，并進(jìn)行肺組織取材。

2.3.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)小鼠白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）、乙酰膽堿（ACH）、乙酰膽堿酯酶（CHE）活力變化情況。

2.3.3 肺組織HE染色 取小鼠肺組織，大體觀察后以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。待石蠟?zāi)毯螅M(jìn)行病理組織切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，封片，光鏡下觀察，每張切片200倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行拍片。

3 結(jié) 果

3.1 急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) 急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鉤吻不同劑量給藥后，小鼠出現(xiàn)痙攣、驚厥、跳躍，最后呼吸衰竭而死，死亡時(shí)間均在給藥后30 min內(nèi)。當(dāng)鉤吻劑量≥1.5 g／kg時(shí)，小鼠死亡率均為100%，見(jiàn)表 1，故確定鉤吻的Dm劑量為1.5 g／kg，進(jìn)行下一步急性毒性實(shí)驗(yàn)。

表1 鉤吻的急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 各組急性毒性實(shí)驗(yàn)情況比較結(jié)果顯示予1.5 g／kg鉤吻后小鼠全部死亡。當(dāng)配伍抵當(dāng)湯后，小鼠死亡率均下降，且死亡時(shí)間亦明顯延長(zhǎng)，與鉤吻組比較有顯著性差異（P＜0.05），見(jiàn)表2。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用鉤吻配抵當(dāng)湯醇提液進(jìn)一步考察其減毒作用。

3.3 鉤吻配伍抵當(dāng)湯對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響 如表3所示，進(jìn)一步考察藥物對(duì)小鼠血液影響，發(fā)現(xiàn)鉤吻組小鼠RBC、PLT、HGB、ACH均與空白組呈顯著性差異（P＜0.05），抵當(dāng)湯鉤吻混合液組小鼠RBC、PLT、HGB、ACH 均與鉤吻組呈顯著性差異（P＜0.05），而與空白組無(wú)顯著性差異；而抵當(dāng)湯與鉤吻給藥前后對(duì)白細(xì)胞、乙酰膽堿酯酶活力卻并無(wú)影響。

3.4 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化 空白組小鼠的肺組織可見(jiàn)細(xì)支氣管與小靜脈；細(xì)支氣管及其分支和肺泡、肺泡壁、肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)充血、水腫、纖維素滲出，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。鉤吻組肺組織可見(jiàn)細(xì)支氣管、肺泡壁、肺間質(zhì)見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)伴充血，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔漿液、紅細(xì)胞等滲出，可見(jiàn)局灶性肺組織實(shí)變。鉤吻與抵當(dāng)湯醇提液混合給藥后小鼠肺組織可見(jiàn)細(xì)支氣管、肺泡壁、肺間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)伴充血減輕，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張不明顯，肺泡腔滲出減少，肺組織局灶性實(shí)變消失。見(jiàn)圖1。結(jié)果表明抵當(dāng)湯與鉤吻混合后可以降低鉤吻的毒性，改善小鼠肺組織中毒癥狀。

表2 各組急性毒性實(shí)驗(yàn)情況比較

表3 鉤吻配伍抵當(dāng)湯對(duì)小鼠血液、肺組織的影響（x±s）

4 討 論

通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抵當(dāng)湯能減緩鉤吻毒性，而傳統(tǒng)水煎和醇提方式抵當(dāng)湯解鉤吻毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)醇提抵當(dāng)湯解毒效果高于傳統(tǒng)水煎劑，這是否與傳統(tǒng)水煎方法高溫久煎破壞水蛭與大黃的有效成分有關(guān)，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)考察。

血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，小鼠灌服鉤吻后ACH濃度升高，而CHE活力并未受影響。先灌服鉤吻后給抵當(dāng)湯也造成ACH濃度升高，而直接抵當(dāng)湯給藥者ACH亦有升高趨勢(shì)，說(shuō)明抵當(dāng)湯減鉤吻毒性可能不是通過(guò)降低ACH而解毒的。在小鼠灌服鉤吻后造成血液中白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等出現(xiàn)不同程度降低，并從肉眼觀察亦出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。而抵當(dāng)湯與鉤吻混合給藥后并未造成小鼠白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等影響，因此可以推測(cè)鉤吻中毒可能是鉤吻生物堿在小鼠胃腸道中迅速進(jìn)入血管，與小鼠某些功能蛋白結(jié)合且破壞血小板，通過(guò)血液循環(huán)造成呼吸衰竭而致死。先灌服抵當(dāng)湯再灌鉤吻和灌服鉤吻抵當(dāng)湯混合液大大減少小鼠的死亡率，說(shuō)明抵當(dāng)湯可能提前結(jié)合（或絡(luò)合）鉤吻生物堿，且被結(jié)合（或絡(luò)合）的生物堿在抵當(dāng)湯作用下失去毒性，使其灌胃后具有毒性的生物堿減少；也可能抵當(dāng)湯與鉤吻一同進(jìn)入血液循環(huán)時(shí)，促使鉤吻生物堿不能與小鼠血液中的功能蛋白結(jié)合，保護(hù)了機(jī)體組織，從而起到減毒作用，但具體機(jī)制可待進(jìn)一步研究其血液中蛋白組學(xué)。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖（×200）

通過(guò)考察鉤吻與抵當(dāng)湯先后順序給藥，抵當(dāng)湯水提液與醇提液均可降低小鼠死亡率，延長(zhǎng)小鼠死亡時(shí)間，抵當(dāng)湯可以減鉤吻毒性，其中先灌服抵擋湯后鉤吻者效果更佳。不同提取方式的抵當(dāng)湯減鉤吻毒性時(shí)，醇提抵當(dāng)湯比傳統(tǒng)水煎減毒效果更優(yōu)。