貝萊斯芽孢桿菌E69預(yù)防稻瘟病等多種真菌病害的潛力

沙月霞，隋書婷，曾慶超，沈瑞清

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貝萊斯芽孢桿菌E69預(yù)防稻瘟病等多種真菌病害的潛力

沙月霞1，隋書婷2，曾慶超2，沈瑞清1

（1寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，銀川 750011；2中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193）

【】明確水稻內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌（）菌株E69對多種植物病原真菌的拮抗作用，尤其是對稻瘟病的生物防治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。貝萊斯芽孢桿菌菌株E69和枯草芽孢桿菌（，稻瘟病生物防治最常用微生物）菌株E66分離于水稻葉片內(nèi)生細(xì)菌，采用對峙培養(yǎng)法測試菌株E69和E66及其發(fā)酵液、無菌上清液對稻瘟病菌（）的拮抗作用，并測試兩株內(nèi)生芽孢桿菌對立枯絲核菌（）、鐮孢菌（spp.）、番茄灰霉病菌（）、草莓炭疽病菌（）、煙草黑脛病菌（var.）、鏈格孢菌（）、西瓜枯萎病菌（）等11種植物病原菌的拮抗作用，溫室條件下檢測對水稻葉瘟的預(yù)防效果，田間試驗(yàn)檢測對水稻葉瘟和穗頸瘟的預(yù)防效果，常規(guī)抑菌測試法研究對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用。采用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白標(biāo)記后的工程菌株E69在水稻莖部的定殖情況。菌株E69和E66對稻瘟病菌菌絲生長具有顯著拮抗作用，溫室條件下兩個菌株對稻瘟病的預(yù)防效果分別為83.24%和76.57%，對葉瘟的田間預(yù)防效果分別為85.97%和79.76%，對穗頸瘟的田間預(yù)防效果分別為69.67%和68.82%，E69對葉瘟的預(yù)防效果顯著高于75%的三環(huán)唑可濕性粉劑，對穗頸瘟的預(yù)防效果與三環(huán)唑無顯著差異。菌株E69和E66對立枯絲核菌、鐮孢菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、煙草黑脛病菌、葉枯病菌、西瓜枯萎病菌等11種植物病原菌有顯著拮抗作用，E69的拮抗作用明顯高于E66。菌株E69和E66能夠強(qiáng)烈抑制稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成，E69發(fā)酵液的抑菌效果分別為95.28%和94.16%，無菌上清液的抑菌效果分別為85.36%和84.31%；E66發(fā)酵液對分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑菌效果分別為89.15%和87.38%，無菌上清液的抑菌效果分別為79.65%和72.45%。綠色熒光蛋白GFP78標(biāo)記后的工程菌株E69在水稻莖部具有較好的定殖能力，可以穩(wěn)定定殖在水稻莖部表皮、薄壁組織和維管束。貝萊斯芽孢桿菌菌株E69是一種潛在的、預(yù)防效果明顯的生防菌株，具有預(yù)防稻瘟病兼防紋枯病等多種真菌病害的應(yīng)用潛力。

貝萊斯芽孢桿菌；稻瘟病；植物病原真菌；生物防治；定殖能力

0 引言

【研究意義】水稻是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物，稻瘟?。╮ice blast）是危害水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害，其病原菌的無性態(tài)為無性菌類絲孢目梨孢屬灰梨孢菌，有性態(tài)為子囊菌門巨座殼目巨座殼屬[1]。稻瘟病發(fā)生范圍廣泛，平均每年造成20%—30%的產(chǎn)量損失，流行年份損失達(dá)到50%以上，嚴(yán)重的甚至絕產(chǎn)[2]。水稻抗病品種選育、農(nóng)藝措施和化學(xué)農(nóng)藥防治是目前生產(chǎn)上最常用的措施，由于稻瘟病菌生理小種易變異，抗病品種選育一般時間較長；化學(xué)農(nóng)藥的使用容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性且對生態(tài)環(huán)境和人類健康有一定影響。因此，尋找一種安全、環(huán)境友好并具有良好防治效果的新型生防菌對水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芽孢桿菌產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的芽孢，對生態(tài)環(huán)境無污染，可以與環(huán)境中的其他微生物互作，具有廣譜的抑菌活性，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性，是稻瘟病防治研究的熱點(diǎn)之一[3]。目前在稻瘟病防治中應(yīng)用較多的芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌（）[4]、解淀粉芽孢桿菌（.）[5]、短小芽孢桿菌（.）[6]、地衣芽孢桿菌（.）、多粘類芽孢桿菌（）和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（.）等。但是已報(bào)道的芽孢桿菌大多來源于根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria）[7]、土壤[8]和植株表面[9]，較少來源于植物內(nèi)生菌。植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[10-11]，具有非常重要的生態(tài)功能[12-13]，包括具有較強(qiáng)且廣譜的抑菌防蟲作用[14-15]、促生增產(chǎn)作用[16-17]、促進(jìn)植株體內(nèi)氮等營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化與吸收[18-19]、增強(qiáng)寄主抗逆性[20-21]、降解重金屬污染和農(nóng)藥殘留[22]等，可以用于研制生物殺菌劑[23]和微生物肥料[24]。關(guān)于植物內(nèi)生菌防治稻瘟病的研究國內(nèi)外雖有不少報(bào)道，但是植物內(nèi)生芽孢桿菌防治稻瘟病的研究尚處于探索階段。Jha等[25]研究表明，分離于水稻根系內(nèi)生菌的類產(chǎn)堿假單胞菌（）GJ17對稻瘟病菌的生防效果明顯高于根際促生菌短小芽孢桿菌；Zhu等[26]研究表明，內(nèi)生真菌柿假尾胞菌（）和菌核青霉（）對稻瘟病菌菌絲生長的抑制率分別達(dá)78.02%和62.81%。生防微生物在植株上的定殖、擴(kuò)散和生存競爭能力是考核生防作用的重要指標(biāo)之一[27-28]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌（）菌株E69為筆者實(shí)驗(yàn)室前期從寧夏回族自治區(qū)水稻葉片中分離得到，其對稻瘟病菌、立枯絲核菌（）等多種病原真菌的拮抗作用和生防應(yīng)用潛力有待明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探明貝萊斯芽孢桿菌菌株E69對稻瘟病的預(yù)防效果和對立枯絲核菌等11種病原真菌的拮抗作用，明確其對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用以及在水稻莖部的定殖情況，為應(yīng)用E69菌株預(yù)防稻瘟病、紋枯病、灰霉病、葉枯病等真菌病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)田概況

田間試驗(yàn)于2018年在寧夏回族自治區(qū)平羅縣姚伏鎮(zhèn)（106.52°E，38.91°N）水稻種植主栽地區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)地常年種植水稻，稻瘟病每年普遍發(fā)生，行距為30 cm，正常肥水管理，試驗(yàn)期間不噴施其他殺菌劑。土壤類型為草甸土，碳酸鈣含量5—78 g·kg-1，全磷含量：0.32—0.49 g·kg-1，全鉀含量：16.7—29.5 g·kg-1，全氮含量：0.14—0.94 g·kg-1，pH 7.2—8.8，有機(jī)質(zhì)含量1.2—13.1 g·kg-1。

1.2 生防菌、病原菌及其培養(yǎng)

稻瘟病菌P131由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。尖鐮孢（）N16-2-1、茄鐮孢（）N18-1-2、串珠鐮孢（）N19-2-2、立枯絲核菌RS8由筆者實(shí)驗(yàn)室分離；西瓜枯萎病菌（f. sp.）M8、番茄灰霉病菌（）ZDP4、草莓炭疽病菌（）ZDP21、蘋果葉枯病菌鏈格孢菌（）BJ-A5、海棠葉枯病菌鏈格孢菌BJ-H9、煙草黑脛病菌（var.）T15、草莓葉枯病菌鏈格孢菌BJ-ST24由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所分離。田間試驗(yàn)水稻品種寧粳47，溫室試驗(yàn)水稻品種G19，均為寧夏水稻種植地區(qū)主栽品種。

水稻內(nèi)生芽孢桿菌菌種：貝萊斯芽孢桿菌E69和枯草芽孢桿菌E66是從寧夏回族自治區(qū)水稻葉片中分離得到的內(nèi)生菌，GFP標(biāo)記菌株為采用綠色熒光蛋白GFP78標(biāo)記后的E69。

2個水稻內(nèi)生芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上活化，在37℃黑暗條件下培養(yǎng)。稻瘟病菌P131的活化和培養(yǎng)在番茄燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行。11種其他植物病原真菌菌株在PDA平板上活化和培養(yǎng)。

1.3 對峙培養(yǎng)

在番茄燕麥平板培養(yǎng)基中央放置稻瘟病菌菌餅（1 cm），待稻瘟病菌菌落生長2 d后，分別在菌落邊緣相距2 cm處接種芽孢桿菌菌餅（5 mm），有一側(cè)為空白對照，置于培養(yǎng)箱28℃黑暗培養(yǎng)，4次重復(fù)。4 d后測量病原菌菌落直徑。

在PDA培養(yǎng)基平板上中央放置上述11種植物病原菌的菌餅（1 cm），分別在菌落邊緣兩側(cè)相距2 cm處接種芽孢桿菌菌株（劃線2 mm），置于培養(yǎng)箱28℃黑暗培養(yǎng)，5 d后測量病原菌菌落直徑和抑菌帶。

1.4 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病的防治效果

溫室試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個處理：處理Ⅰ-CK為清水對照；Ⅱ-菌株E66發(fā)酵液；Ⅲ-菌株E69發(fā)酵液； Ⅳ-75%三環(huán)唑可濕性粉劑（陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技（中國）有限公司）；Ⅴ-綠地康1號（中農(nóng)綠康（北京）生物技術(shù)有限公司）。每處理4個重復(fù)。水稻種植28 d后，CK噴施無菌水，處理Ⅱ、Ⅲ噴施內(nèi)生芽孢桿菌發(fā)酵液，噴霧芽孢濃度為1×108CFU/mL，處理Ⅳ噴施20%的三環(huán)唑水溶液，處理Ⅴ噴施綠地康1號的100倍稀釋液，每個水桶種植5株水稻，噴施20 mL。24 h后所有處理均噴施20 mL稻瘟病菌孢子懸浮液（1×106CFU/mL）。7 d后調(diào)查葉瘟發(fā)生情況。

田間試驗(yàn)地點(diǎn)在平羅縣姚伏鎮(zhèn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個處理：CK為清水對照；菌株E66和E69，噴霧芽孢濃度為1×108CFU/mL；75%三環(huán)唑可濕性粉劑；綠地康1號。分別在水稻插秧后30、45、60、75和90 d葉面噴施菌劑發(fā)酵液、75%三環(huán)唑可濕性粉劑和綠地康1號。75%三環(huán)唑可濕性粉劑的用藥量為1.05—1.20 kg·hm-2，藥液量為600—750 kg·hm-2。綠地康1號的用藥量為7.50 L·hm-2（有效活菌數(shù)≥1×109/mL），藥液量為2 400 kg·hm-2。稻瘟病在試驗(yàn)田每年均有發(fā)生，插秧后45 d調(diào)查試驗(yàn)田葉瘟的發(fā)生情況，插秧后100 d調(diào)查穗頸瘟的發(fā)生狀況，調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T15970—1995）。試驗(yàn)小區(qū)采取隨機(jī)排列，小區(qū)平均面積50 m2，每處理4個重復(fù)小區(qū)。

1.5 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

枯草芽孢桿菌E66和貝萊斯芽孢桿菌E69的發(fā)酵液（芽孢濃度為1×108CFU/mL）、無菌上清液（發(fā)酵液離心后的上清液經(jīng)0.22 μm抽濾）分別與稻瘟病菌孢子懸浮液（1×106CFU/mL）以1﹕1的比例混勻，混合液在無菌12孔板中28℃對峙培養(yǎng)24 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察稻瘟病菌P131分生孢子萌發(fā)和附著胞形成情況，每次觀察200個分生孢子。

1.6 貝萊斯芽孢桿菌E69在水稻植株上的定殖

水稻種植20 d時，用已成功標(biāo)記綠色熒光蛋白GFP的貝萊斯芽孢桿菌E69發(fā)酵液（芽孢濃度為1×108CFU/mL）噴施植株，7 d后用LEICA 3050S冷凍切片機(jī)做水稻莖部橫切面和縱切面的冷凍切片，厚度約20 μm，用LEICATCS SP8激光共聚焦顯微鏡觀察供試菌株在水稻植株的定殖情況。激發(fā)光是綠光，波長為488 nm，采用Photoshop11.0圖片編輯軟件編輯照片。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)在Excel 2007中計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用DPS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方差分析選用單因素分析中的最長距離法計(jì)算（＜0.05）。

計(jì)算公式：病情指數(shù)＝[∑各級病葉（穗）數(shù)×相對級數(shù)值]/[調(diào)查總?cè)~（穗）數(shù)×9]×100；預(yù)防效果（%）＝[（CK 病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/CK病情指數(shù)]×100。

2 結(jié)果

2.1 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病菌的拮抗作用

水稻內(nèi)生芽孢桿菌菌株E69和E66均能夠顯著抑制稻瘟病菌P131的生長，拮抗作用明顯，相對菌絲抑制率分別達(dá)到90.36%和92.56%，其發(fā)酵液和無菌上清液的抑菌作用也較為明顯（圖1）。

A：稻瘟病菌P131生長9 d的菌落形態(tài)The colony morphology of M. oryzae P131 growing for 9 d；B：拮抗菌E69與稻瘟病菌P131對峙培養(yǎng)The colony of M. oryzae P131 inhibited by strain E69；C：拮抗菌E66與稻瘟病菌P131對峙培養(yǎng)The colony of M. oryzae P131 inhibited by strain E66；D：稻瘟病菌P131生長6 d的菌落形態(tài)The colony morphology of M. oryzae P131 growing for 6 d；E：拮抗菌E69發(fā)酵液與稻瘟病菌P131對峙培養(yǎng)The colony of M. oryzae P131 inhibited by fermented liquid of strain E69；F：拮抗菌E69無菌上清液與稻瘟病菌P131對峙培養(yǎng)The colony of M. oryzae P131 inhibited by sterile supernatant of strain E69；G：拮抗菌E66發(fā)酵液與稻瘟病菌P131對峙培養(yǎng)The colony of M. oryzae P131 inhibited by fermented liquid of strain E66；H：拮抗菌E66無菌上清液與稻瘟病菌P131對峙培養(yǎng)The colony of M. oryzae P131 inhibited by sterile supernatant of strain E66

2.2 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病的預(yù)防效果

2株水稻內(nèi)生芽孢桿菌在溫室條件下對稻瘟病有顯著預(yù)防效果（表1），貝萊斯芽孢桿菌E69對稻瘟病的預(yù)防效果為83.24%，與對照生物農(nóng)藥綠地康的預(yù)防效果（84.51%）無顯著差異（＞0.05），顯著高于化學(xué)農(nóng)藥75%三環(huán)唑可濕性粉劑的預(yù)防效果（77.91%）（＜0.05）。枯草芽孢桿菌E66的預(yù)防效果與三環(huán)唑無顯著差異（＞0.05），顯著低于菌株E69的預(yù)防效果（＜0.05）。

2株水稻內(nèi)生芽孢桿菌對葉瘟的田間預(yù)防效果顯著（表2）。貝萊斯芽孢桿菌E69預(yù)防水稻葉瘟的效果達(dá)到85.97%，與綠地康的預(yù)防效果無顯著性差異（＞0.05），與三環(huán)唑的預(yù)防效果差異顯著（＜0.05）。菌株E66對葉瘟的田間預(yù)防效果與三環(huán)唑無顯著性差異（＞0.05）。各處理對穗頸瘟的效果無顯著性差異（＞0.05）。對穗頸瘟的田間預(yù)防效果較低，分析原因主要是試驗(yàn)田在施肥管理上出現(xiàn)失誤，生產(chǎn)過程中誤施過量尿素，導(dǎo)致穗頸瘟大發(fā)生，影響了E69的田間應(yīng)用效果。

表1 水稻內(nèi)生芽孢桿菌在溫室條件下對稻瘟病的預(yù)防效果

數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different lowercases after the data indicate significantly different (＜0.05). The same as below

表2 水稻內(nèi)生芽孢桿菌預(yù)防稻瘟病的田間效果

Table 2 The preventive efficacy of rice endophytic bacteria against rice blastin the field

2.3 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對立枯絲核菌等病原菌的拮抗作用

2株水稻內(nèi)生芽孢桿菌對多種植物病原菌具有顯著抑菌作用（表3）。貝萊斯芽孢桿菌E69對尖鐮孢、茄鐮孢和串珠鐮孢的抑菌效果＞80%，對立枯絲核菌、番茄灰霉病菌、蘋果葉枯病菌和海棠葉枯病菌的抑菌效果在71%—80%，對草莓炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和煙草黑脛病的抑菌效果在61%—70%，對草莓葉枯病菌的抑菌效果＜60%。枯草芽孢桿菌E66對立枯絲核菌的抑菌效果在71%—80%，對尖鐮孢、蘋果葉枯病菌、海棠葉枯病菌和西瓜枯萎病菌的抑菌效果在61%—70%，對其他病原菌的抑菌效果＜60%?？莶菅挎邨U菌E66對11種植物病原菌具有拮抗作用，但是抑菌效果明顯小于菌株E69。

表3 菌株E69和E66對多種植物病原菌的拮抗作用

+、++、+++和++++代表相對菌絲抑制率分別為50%—60%、61%—70%、71%—80%和＞80%

+, ++, +++ and ++++ represent relative inhibition rates against mycelia growth of each fungal colony on the PDA medium to the extent of 50%- 60%, 61%-70%, 71%-80% and ＞80%, respectively

2.4 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用

2株水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成具有顯著的抑制作用（表4）。貝萊斯芽孢桿菌E69發(fā)酵液對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用分別是95.28%和94.16%，無菌上清液的抑制作用分別是85.36%和84.31%?？莶菅挎邨U菌E66發(fā)酵液和無菌上清液對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞形成也具有明顯抑制作用，但是抑菌效果較菌株E69低。

2.5 貝萊斯芽孢桿菌E69在水稻莖部的定殖

采用CLSM觀察貝萊斯芽孢桿菌E69在水稻莖部的定殖（圖2）。噴施后第7天，在水稻莖部檢測到菌株E69的GFP綠色熒光。在縱切面的表皮、基本組織和維管束中觀察到標(biāo)記菌株，尤其是表皮的綠色熒光較強(qiáng)，向內(nèi)逐步減弱。在橫切面的表皮、薄壁組織和中央維管束系統(tǒng)中也觀察到的綠色熒光，強(qiáng)弱程度與縱切面一致。說明E69從表皮進(jìn)入莖部組織，向薄壁組織和中央維管束系統(tǒng)擴(kuò)展遷移。在無菌水噴霧處理的水稻莖部組織中未發(fā)現(xiàn)有熒光標(biāo)記的E69。

表4 水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用

Table 4 Inhibitory activity of rice endophytic bacteria against conidial germination and appressorial formation of

3 討論

芽孢桿菌對植物病原菌的生防機(jī)制主要包括競爭作用、拮抗作用和誘導(dǎo)抗病性，有的菌株以一種生防機(jī)制為主，有的菌株則以多種生防機(jī)制協(xié)同作用相互增強(qiáng)了對病原菌的拮抗作用[29]。芽孢桿菌具有防治植物病害的優(yōu)良特性，在世界范圍內(nèi)被廣泛用作商品化的生防制劑。一般來源于植物內(nèi)部組織的芽孢桿菌抗菌譜較廣，抑菌效果明顯，受環(huán)境因素影響較小，是廣大植物病理工作者研究的熱點(diǎn)之一。但是目前植物內(nèi)生芽孢桿菌的商品化研發(fā)還處于探索階段，獲得對多種植物病原菌具有拮抗作用的內(nèi)生芽孢桿菌并用做生防制劑，一直是植物病害生物防治研究的重要內(nèi)容。

目前，在水稻生產(chǎn)上用于稻瘟病生物防治的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，已有研究表明貝萊斯芽孢桿菌對多種植物病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用[30-31]，但國內(nèi)還未有學(xué)者研究過其對稻瘟病菌的拮抗作用，本研究證實(shí)了貝萊斯芽孢桿菌對稻瘟病具有較明顯的預(yù)防效果，不僅為稻瘟病殺菌劑的研發(fā)提供了新型微生物資源，而且拓寬了貝萊斯芽孢桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域。生防芽孢桿菌大多來源于植株根際、非根際土壤或植株體表，而采用植物內(nèi)生菌預(yù)防稻瘟病的研究報(bào)道較少。貝萊斯芽孢桿菌E69和枯草芽孢桿菌E66菌株均來源于水稻葉片內(nèi)生菌，研究結(jié)果進(jìn)一步印證了植物內(nèi)生菌具有廣泛的生物活性，具備應(yīng)用于防治稻瘟病等多種真菌病害的生防潛力。

水稻內(nèi)生芽孢桿菌對稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞形成具有顯著抑菌作用，貝萊斯芽孢桿菌E69發(fā)酵液幾乎完全抑制孢子萌發(fā)和附著胞的形成；無菌上清液的抑菌作用也較明顯，對孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑菌率達(dá)到84%以上。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)拮抗作用是E69菌株防治稻瘟病的機(jī)制之一。芽孢桿菌對病原菌的拮抗作用主要包括抑菌作用和溶菌作用[32-33]，之所以會產(chǎn)生不同的拮抗機(jī)制源于菌株產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，包括酶類、細(xì)菌素、脂肽類以及揮發(fā)性物質(zhì)等[34]。之前的研究表明，貝萊斯芽孢桿菌E69產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和葡聚糖酶，揮發(fā)性物質(zhì)對稻瘟病菌菌絲生長的抑制效果達(dá)到95%以上，但具體哪類抗菌活性物質(zhì)抑制了孢子萌發(fā)和附著胞形成有待于深入研究。

在稻瘟病的田間防治中，一般環(huán)境中微生物會與生防菌競爭營養(yǎng)、空氣和生態(tài)位點(diǎn)，可能會影響生防菌在植株體內(nèi)的定殖，進(jìn)而導(dǎo)致防治效果下降[35-36]。而植物內(nèi)生生防菌與寄主體內(nèi)的微生物相容性好，比土壤和其他來源的生防菌在植物體內(nèi)更容易定殖、擴(kuò)展和遷移。大量的研究證實(shí)，生防菌能否有效在植株體內(nèi)定殖是生防效果能否穩(wěn)定、持效的重要因素[37-38]。本研究檢測了綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記后的貝萊斯芽孢桿菌E69在水稻莖部的定殖狀況，在水稻表皮組織、薄壁組織和維管束中具有較好的定殖能力。GFP是廣泛應(yīng)用的標(biāo)記分子，不會改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和活性[39]，對細(xì)胞無毒，常被研究人員作為標(biāo)記基因用來研究微生物在植株體內(nèi)的定殖規(guī)律[40]。筆者還研究了GFP標(biāo)記后的菌株與原始菌株之間在生長曲線、抑菌作用之間的差異，證實(shí)GFP標(biāo)記的工程菌株與原始菌株在抑菌活性和生長動力學(xué)方面沒有明顯差異（另文發(fā)表），因此可以用GFP作為標(biāo)記基因研究貝萊斯芽孢桿菌在水稻植株上的定殖情況。

篩選并利用具有多種拮抗機(jī)制的芽孢桿菌作為生防菌劑是植物病害生物防治研究的重要內(nèi)容。NG等[41]研究表明，解淀粉芽孢桿菌UPMS3和多種微生物混配的微生物菌肥可以顯著提高生防菌的活性；Kanjanamaneesathian等[42]將巨大芽孢桿菌（）浸種和葉面噴霧，結(jié)合施用氮肥，可以有效預(yù)防穗頸瘟；Kyung-Seok等[43]發(fā)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌（）EXTN-1誘導(dǎo)作物PR基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病性，防治稻瘟病效果達(dá)52.11%。本研究結(jié)果證實(shí)了貝萊斯芽孢桿菌E69具有廣譜抗菌活性，溫室條件下對稻瘟病的預(yù)防效果明顯，為應(yīng)用于稻瘟病的防治提供了依據(jù)。田間大區(qū)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，E69預(yù)防水稻葉瘟的效果較好，與綠地康的預(yù)防效果相當(dāng)，對穗頸瘟也有一定的效果，顯示出E69良好的生防應(yīng)用價(jià)值。另外，對11種植物病原真菌的菌絲抑制試驗(yàn)表明，該菌株作為生防制劑可能同時具有防治紋枯病、番茄灰霉病等多種真菌病害的潛力。

4 結(jié)論

貝萊斯芽孢桿菌菌株E69對稻瘟病具有明顯的生防效果，并且具有廣譜的抑菌活性，能夠穩(wěn)定定殖在水稻植株體內(nèi)，具有在稻瘟病的田間防治中推廣應(yīng)用的潛力。E69發(fā)酵液和無菌上清液均可顯著抑制稻瘟病菌的分生孢子萌發(fā)和附著胞形成。因此，貝萊斯芽孢桿菌E69是一種潛在的、有效的生防菌株，具有防治稻瘟病、紋枯病、葉枯病、炭疽病、灰霉病、土傳病害和煙草黑脛病等多種真菌病害的潛力。

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Biocontrol Potential ofStrain E69 Against Rice Blast and Other Fungal Diseases

SHA YueXia1, SUI ShuTing2, ZENG QingChao2, SHEN RuiQing1

(1Institute of Plant Protection, Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Yinchuan 750011;2College of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193)

【】The objective of this study is to clarify the antagonistic effect ofstrain E69 isolated from rice endophytic bacteria against various fungal plant pathogens, especially the control efficacy ofE69 on rice blast, and to reduce the use of chemical pesticides.【】E69 and(most commonly used microorganisms in biological control of rice blast) E66 strains were isolated from endophytic bacteria of rice leaf tissue. The antagonistic effect of strains E69 and E66 and their fermented liquid, sterile supernatant againstwas tested by confrontation culture method. Also, the antagonistic effect of strains E69 and E66 against other 11 pathogenic fungi, such as,spp.,,,var.,,,., was determined. The preventive efficacy of E69 and E66 was tested for the control of rice leaf blast under greenhouse condition. The field experiments were conducted to evaluate the preventive efficacy of E69 and E66 against rice leaf blast and neck blast. The inhibitory effect of E69 and E66 against conidial germination and appressorial formation ofwas assessed in laboratory. The colonization of gfp-marked strain E69 in rice stem was observed by laser scanning confocal microscope.【】Strains E69 and E66 significantly suppressed the mycelia growth rate ofP131, the preventive efficacy against rice blast under greenhouse condition was 83.24% and 76.57%, respectively. The preventive efficacy of E69, E66 against rice leaf blast and neck blast in field was 85.97%, 79.76% and 69.67%, 68.82%, respectively. The preventive effect of E69 on leaf blast was significantly higher than that of 75% tricyclozole wettable powder, but there was no significant difference between the preventive efficacy of strain E69 and 75% tricyclazole powder against rice neck blast. E69 and E66 had significant antagonistic effects against 11 plant pathogens, such as,spp.,,,var.,,,. The antagonistic effect of E69 was higher than that of E66. E69 and E66 could strongly inhibit the conidial germination and appressorial formation ofP131, the inhibitory effect of E69 fermented liquid was 95.28% and 94.16%, respectively, and the inhibitory effect of E69 sterile supernatant was 85.36% and 84.31%, respectively. The inhibitory effect of E66 fermented liquid was 89.15% and 87.38%, respectively, and the inhibitory effect of E66 sterile supernatant were 79.65% and 72.45%, respectively. The gfp-marked strain E69 showed good colonization ability in rice stem, and could be stably colonized in rice stem epidermis, parenchyma and vascular bundles. 【】strain E69 is a potential biocontrol strain with obvious preventive effects, which has the application potential of preventing rice blast, sheath blight and other fungal diseases.

; rice blast; plant pathogenic fungi; biological control; colonization ability

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.006

2019-01-29；

2019-03-11

寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技先導(dǎo)資金項(xiàng)目（NKYJ-16-26）、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201606）、寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018BBF02018-06）、寧夏農(nóng)林科學(xué)院全產(chǎn)業(yè)鏈創(chuàng)新示范項(xiàng)目（QCYL-2018-09）

沙月霞（通信作者），E-mail：yuexiasha@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）