廣西玉米穗腐病致病鐮孢種群構(gòu)成與毒素化學(xué)型分析

杜青，唐照磊，李石初，上官玲玲，李華嬌，段燦星

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廣西玉米穗腐病致病鐮孢種群構(gòu)成與毒素化學(xué)型分析

杜青1，唐照磊1，李石初1，上官玲玲2，李華嬌2，段燦星3

（1廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，南寧 530007；2廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530007；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京 100081）

【】明確廣西玉米穗腐病致病鐮孢的種群構(gòu)成及毒素化學(xué)型，為玉米穗腐病的綜合防治、品種的合理布局和抗病育種提供重要指導(dǎo)和理論依據(jù)。從廣西玉米主產(chǎn)區(qū)采集玉米穗腐病樣本，經(jīng)組織分離和單孢純化共獲得138個(gè)鐮孢菌分離物，分別來自21個(gè)縣（區(qū)）。利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鐮孢菌種的鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用產(chǎn)毒基因特異性引物進(jìn)行毒素化學(xué)型檢測(cè)。在138個(gè)鐮孢菌分離物中，鑒定出10種鐮孢菌，包括擬輪枝鐮孢（）、層出鐮孢（）、九州鐮孢（）、南方鐮孢（）、甘蔗鐮孢（）、藤倉鐮孢（）、亞洲鐮孢（）、輪紋鐮孢（）、變紅鐮孢（）和禾谷鐮孢（），分離頻率依次為50.72%、12.32%、10.87%、8.70%、6.52%、3.62%、3.62%、1.45%、1.45%和0.72%。禾谷鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)GSC）由南方鐮孢、亞洲鐮孢和禾谷鐮孢3個(gè)獨(dú)立種組成。擬輪枝鐮孢為優(yōu)勢(shì)致病菌，禾谷鐮孢復(fù)合種、層出鐮孢和九州鐮孢為次優(yōu)勢(shì)致病菌，而甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢則是國內(nèi)首次報(bào)道為玉米穗腐病致病菌。擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢和藤倉鐮孢檢測(cè)到伏馬毒素關(guān)鍵合成基因的菌株數(shù)分別為67、13、5、3，具有潛在的產(chǎn)伏馬毒素能力，輪紋鐮孢則未檢測(cè)到。供試禾谷鐮孢復(fù)合種、九州鐮孢和變紅鐮孢菌株的毒素化學(xué)型有4種：NIV、15-ADON、NIV+15-ADON和DON+15-ADON。8個(gè)九州鐮孢菌株、2個(gè)亞洲鐮孢菌株、2個(gè)南方鐮孢菌株和1個(gè)變紅鐮孢菌株攜帶NIV毒素化學(xué)型；2個(gè)南方鐮孢菌株攜帶15-ADON毒素化學(xué)型；8個(gè)南方鐮孢菌株、2個(gè)九州鐮孢菌株、1個(gè)亞洲鐮孢菌株和1個(gè)變紅鐮孢菌株攜帶NIV+15-ADON毒素化學(xué)型；只有1個(gè)禾谷鐮孢菌株攜帶DON+15-ADON毒素化學(xué)型。未檢測(cè)到3-ADON毒素化學(xué)型菌株。擬輪枝鐮孢為廣西玉米穗腐病優(yōu)勢(shì)致病菌，禾谷鐮孢復(fù)合種、層出鐮孢和九州鐮孢為次優(yōu)勢(shì)致病菌。擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢、藤倉鐮孢均檢測(cè)到，廣西禾谷鐮孢復(fù)合種的主要毒素化學(xué)型為NIV和15-ADON，變紅鐮孢和部分九州鐮孢的主要毒素化學(xué)型為NIV。廣西玉米穗腐病鐮孢菌種群構(gòu)成與我國溫帶玉米相關(guān)研究結(jié)果存在差異，原因可能為鐮孢菌種群適應(yīng)廣西熱帶和亞熱帶高溫、高濕的玉米生長環(huán)境并因此導(dǎo)致毒素化學(xué)型的不同。

玉米；穗腐病；鐮孢菌；分離頻率；毒素化學(xué)型

0 引言

【研究意義】玉米穗腐?。╩aize ear rot）是玉米生產(chǎn)中的重要病害之一，在世界范圍發(fā)生十分普遍，也是廣西最常見的玉米真菌病害之一。鐮孢菌（spp.）是玉米最普遍的致病真菌之一，引起的病害包括玉米苗枯病、莖腐病和穗腐病。玉米果穗感染鐮孢菌后通常會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降，更重要的是收獲感染了鐮孢菌的果穗，可能會(huì)導(dǎo)致真菌毒素的污染，危害人畜健康[1-5]。明確廣西玉米穗腐病致病鐮孢的種群構(gòu)成及毒素化學(xué)型，可為玉米穗腐病的病害流行、綜合防治、抗病育種等相關(guān)研究提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外多數(shù)研究認(rèn)為擬輪枝鐮孢（）和禾谷鐮孢（）是玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)種，但各地的鐮孢菌種群組成和結(jié)構(gòu)存在較大差異。我國春玉米區(qū)，禾谷鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)GSC）總分離頻率最高，其次為擬輪枝鐮孢、亞粘團(tuán)鐮孢（）等[2]，而黃淮海夏玉米區(qū)以擬輪枝鐮孢最高，其次為禾谷鐮孢[3]。周丹妮等[4]對(duì)重慶及周邊地區(qū)的玉米穗腐病鐮孢菌進(jìn)行了序列分析鑒定，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種由南方鐮孢（）和亞洲鐮孢（）組成；Duan等[5]對(duì)我國約20個(gè)省份的玉米穗腐病鐮孢菌進(jìn)行了鑒定，擬輪枝鐮孢和禾谷鐮孢復(fù)合種為優(yōu)勢(shì)種，禾谷鐮孢復(fù)合種中鑒定出3個(gè)獨(dú)立種，分別為禾谷鐮孢、南方鐮孢和布氏鐮孢（）。鐮孢菌種群的致病性比較復(fù)雜，特別是禾谷鐮孢復(fù)合種和藤倉鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)FSC），常規(guī)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)有利于鐮孢菌種群的鑒定，在鐮孢菌種級(jí)水平上的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，基因序列可以較好地表現(xiàn)鐮孢菌種之間的關(guān)系，并已成為鐮孢種鑒定的重要工具[2-7]。已鑒定出40多種病原菌單獨(dú)或復(fù)合侵染均可引發(fā)玉米穗腐病，其中，在大多數(shù)國家和地區(qū)，鐮孢菌是玉米穗腐病的主要病原菌[8]。鐮孢菌可引起兩種類型的玉米穗腐病，分別為赤霉穗腐?。╡ar rot）和鐮孢穗腐?。╡ar rot）[1]，鐮孢穗腐病由擬輪枝鐮孢、層出鐮孢（）、亞粘團(tuán)鐮孢等引起，會(huì)導(dǎo)致伏馬毒素（fumonisins）積累；赤霉穗腐病則主要由禾谷鐮孢、黃色鐮孢（）、燕麥鐮孢（）等引起，會(huì)導(dǎo)致脫氧雪腐鐮刀烯醇（deoxynivalenoe，DON）、雪腐鐮刀烯醇（nivalenol，NIV）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素污染[1,9]。伏馬毒素是世界范圍內(nèi)最常見的玉米及玉米加工品的污染物，玉米相比其他作物更容易受到伏馬毒素污染，在熱帶和亞熱帶環(huán)境下，擬輪枝鐮孢被認(rèn)為是鐮孢穗腐病和伏馬毒素污染的主要因素[1,9]。歐盟、美國和中國等地區(qū)和國家已制定了伏馬毒素、單端孢霉烯族毒素等鐮孢菌毒素在玉米等糧食作物及加工品中的限量標(biāo)準(zhǔn)[10]。2011和2012年甘肅省5個(gè)地區(qū)的225份玉米樣品中，伏馬毒素的污染率分別為30.5%和50.9%[11]。2012—2014年間，77%的埃塞俄比亞玉米籽粒樣品中檢測(cè)到伏馬毒素，伏馬毒素平均濃度為348 μg?kg-1，部分樣品超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米是廣西最主要的糧食作物之一。廣西熱帶、亞熱帶的高溫、高濕氣候特點(diǎn)導(dǎo)致玉米穗腐病發(fā)生非常普遍，然而該病害鐮孢菌致病種群構(gòu)成及毒素污染情況仍不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】于2016—2018年采集廣西玉米穗腐病病樣，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鐮孢種鑒定，利用毒素合成基因特異性引物進(jìn)行毒素化學(xué)型檢測(cè)，為玉米穗腐病的綜合防治、品種的合理布局和抗病育種提供重要指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病樣：2016—2018年從廣西玉米主產(chǎn)區(qū)的24個(gè)區(qū)（縣）采集疑似感染鐮孢菌的玉米病穗167份，將采集樣品裝在牛皮紙袋中帶回實(shí)驗(yàn)室盡快進(jìn)行籽粒帶菌檢測(cè)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂粉和葡萄糖各20 g，蒸餾水1 L；馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L；合成低營養(yǎng)瓊脂（spezieller nahrstoffarmer agar，SNA）培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，KNO31.0 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L；康乃馨葉片（carnation leaf-piece agar，CLA）培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，每個(gè)培養(yǎng)皿中滅菌康乃馨葉片4—5片。

常用儀器：BioRad S 1000 PCR擴(kuò)增儀；Eppendorf 5424 R高速冷凍離心機(jī)；北京市六一儀器廠DYY-6C型電泳儀；BioRad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)；Nikon E-CLIPSE CI-E生物顯微鏡。常用試劑：4S green plus無毒核酸染料，真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與鑒定 挑選果穗病健交界處的籽粒，在3%的次氯酸鈉溶液中表面消毒1 min，無菌水沖洗兩次，然后在PDA平板上培養(yǎng)5—6 d。菌落轉(zhuǎn)移至PDA平板中進(jìn)行純化培養(yǎng)及單孢分離[12]。根據(jù)鐮孢菌在PDA、SNA和CLA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀，參考《TheLaboratory Manual》[13]和《常見鐮刀菌鑒定指南》[14]關(guān)于鐮孢菌分類依據(jù)的描述進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 將鐮孢菌菌株接種到PD液體培養(yǎng)基中，4—7 d后，利用真菌DNA快速提取試劑盒從紗布過濾后的凍干菌絲中提取DNA，將DNA溶解于100 μL TE buffer。種級(jí)特異性引物（表1）用于鐮孢菌種群的初步鑒定，PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序參照周丹妮等[4]。

所有鐮孢菌菌株采用基因序列比對(duì)方法進(jìn)行鑒定[2-7]。EF1（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAG AC-3′）和EF2（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT -3′）引物對(duì)用來擴(kuò)增基因部分序列，30 μL PCR反應(yīng)體系：2×Taq Mix 15 μL，基因組DNA模板2 μL，10 μmol?L-1上下游引物均為1 μL，ddH2O 11 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，53℃退火50 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，Chromas軟件查看測(cè)序ab1文件序列峰圖，DNAman軟件正反向序列比對(duì)拼接，結(jié)合峰圖，獲得可靠DNA序列，登錄GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，利用Mega 7.0軟件ClustalW比對(duì)后采用neighbor-joining（NJ）統(tǒng)計(jì)方法1 000次自檢構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 致病性鑒定 擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、藤倉鐮孢（）、甘蔗鐮孢（）和輪紋鐮孢（）采用PD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，制成濃度為2×106個(gè)孢子/mL的懸浮液，禾谷鐮孢復(fù)合種、九州鐮孢（）和變紅鐮孢（）采用SNA培養(yǎng)孢子，刮取孢子，制成濃度為1×105個(gè)孢子/mL的懸浮液。以清水作對(duì)照，分別于吐絲后10 d針刺果穗注射法[8]穿透苞葉接種2 mL孢子懸浮液至玉米果穗，乳熟后期剝開苞葉調(diào)查病害發(fā)生情況，取病健交界處的籽粒，于培養(yǎng)基上分離和純化，觀察再分離菌株與接種菌株的形態(tài)特征是否一致。

1.2.4 毒素合成基因的分子檢測(cè) 利用Fum5F（5′-GTCGAGTTGTTGACCACTGCG-3′）和Fum5R（5′-CG TATCGTCAGCATGATGTAGC-3′）引物對(duì)檢測(cè)擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢、藤倉鐮孢和輪紋鐮孢的伏馬毒素關(guān)鍵合成基因，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照Duan等[5]的方法進(jìn)行。

對(duì)于禾谷鐮孢、亞洲鐮孢、南方鐮孢、變紅鐮孢和九州鐮孢，采用表2引物檢測(cè)其毒素化學(xué)型。PCR反應(yīng)體系、PCR程序參照馬紅霞等[15]的方法，并略有改動(dòng)。

表1 鐮孢菌種特異性鑒定引物

表2 毒素化學(xué)型檢測(cè)所用引物

2 結(jié)果

2.1 玉米穗腐病樣中鐮孢菌的鑒定及分離頻率

從廣西24個(gè)縣（區(qū)）采集的167份疑似鐮孢菌引起的玉米穗腐病病樣中，分離并鑒定出鐮孢菌、青霉（）、黃曲霉（）、木霉（）、絲核菌（）等，本研究重點(diǎn)對(duì)鐮孢菌進(jìn)行種級(jí)鑒定，結(jié)果見表3。

經(jīng)過單孢分離純化共獲得138個(gè)鐮孢單孢分離物，分別來自廣西21個(gè)主要玉米種植縣（區(qū)），形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，共鑒定出10種致病鐮孢。共分離到103個(gè)藤倉鐮孢復(fù)合種分離物，包括擬輪枝鐮孢（70個(gè)）、層出鐮孢（17個(gè)）、甘蔗鐮孢（9個(gè)）、藤倉鐮孢（5個(gè)）和輪紋鐮孢（2個(gè)），分離頻率依次為50.72%、12.32%、6.52%、3.62%和1.45%。18個(gè)禾谷鐮孢復(fù)合種分離物包括南方鐮孢（12個(gè)）、亞洲鐮孢（5個(gè)）和禾谷鐮孢（1個(gè)），分離頻率依次為8.70%、3.62%和0.72%。此外，還分離到九州鐮孢（15個(gè)）和變紅鐮孢（2個(gè)），分離頻率分別為10.87%和1.45%。不難發(fā)現(xiàn)，擬輪枝鐮孢為廣西玉米穗腐病優(yōu)勢(shì)致病鐮孢，其次是層出鐮孢和九州鐮孢。禾谷鐮孢復(fù)合種以南方鐮孢分離頻率最高，亦具有較強(qiáng)的致病力。擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、九州鐮孢和南方鐮孢分離頻率較高，在百色、河池和崇左市均有不同程度的分布。在南寧市的3個(gè)縣（區(qū)）共獲得到15個(gè)單孢分離物，14個(gè)為擬輪枝鐮孢，只有來賓市武宣縣等少數(shù)縣（區(qū)）未分離到擬輪枝鐮孢。

分別接種甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢孢子懸浮液至玉米果穗，結(jié)果證明甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢均能侵染玉米果穗（圖1-e、1-E），發(fā)病癥狀與擬輪枝鐮孢、層出鐮孢和藤倉鐮孢引起的穗腐病癥狀相似，通常造成果穗局部受害，極少數(shù)整穗腐爛，與禾谷鐮孢復(fù)合種引起的紫紅色病穗?yún)^(qū)別較大。取病健交界處的籽粒分離培養(yǎng)，小型分生孢子、大型分生孢子、小型分生孢子鏈產(chǎn)孢和復(fù)瓶梗假頭狀產(chǎn)孢（圖1-a—d、A—D）等形態(tài)學(xué)特征與擬輪枝鐮孢（孢子鏈更長，單瓶梗產(chǎn)孢為主）差異較大。甘蔗鐮孢與層出鐮孢、藤倉鐮孢間差異相對(duì)較小。

2.2 TEF-1α系統(tǒng)發(fā)育樹

形態(tài)學(xué)和特異性引物擴(kuò)增初步鑒定后，所有菌株均采用引物延伸因子基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株編號(hào)采用“采集縣份+序號(hào)”表示。將138個(gè)鐮孢菌菌株進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，并下載參考菌株基因序列，138個(gè)菌株與參考菌株基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所有菌株均可劃分到彼此獨(dú)立的10個(gè)對(duì)應(yīng)參考菌株的群組中。

表3 廣西21個(gè)縣（區(qū)）鐮孢菌的分離情況

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a、A：小孢子microconidia；b、B：大孢子macroconidia；c、C：孢子鏈microconidia chain；d、D：產(chǎn)孢細(xì)胞conidiogenus cell；e、E：接種后病害癥狀symptom after inoculation。a—e：甘蔗鐮孢F. sacchari；A—E：輪紋鐮孢F. concentricum。a-b, A: scale bar=10 μm; c-d, B-D: scale bar=25 μm

采用部分鐮孢菌與10個(gè)參考菌株的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），禾谷鐮孢群組自展值為90，亞洲鐮孢群組自展值為83，其余8個(gè)群組的自展值均為98—99，高度相似，因此鑒定為與參考菌株相同的鐮孢種。鐮孢菌亦可分為兩個(gè)大的進(jìn)化群組，即藤倉鐮孢復(fù)合種進(jìn)化群組和禾谷鐮孢復(fù)合種、九州鐮孢與變紅鐮孢進(jìn)化群組。藤倉鐮孢復(fù)合種分為擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢、藤倉鐮孢和輪紋鐮孢5個(gè)群組，擬輪枝鐮孢與其他4個(gè)復(fù)合種可以劃分為2個(gè)亞群，藤倉鐮孢和層出鐮孢親緣關(guān)系更近且位于彼此獨(dú)立的群組。禾谷鐮孢復(fù)合種分為禾谷鐮孢、亞洲鐮孢和南方鐮孢3個(gè)群組。

圖2 基于TEF-1α基因序列構(gòu)建部分鐮孢菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 毒素化學(xué)型檢測(cè)

對(duì)擬輪枝鐮孢、藤倉鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢所攜帶產(chǎn)伏馬毒素合成關(guān)鍵基因進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖3-a），88個(gè)菌株能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，占比85.43%，表明這88個(gè)菌株攜帶伏馬毒素關(guān)鍵合成基因，具有潛在的產(chǎn)伏馬毒素能力。擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢和藤倉鐮孢檢測(cè)到的菌株數(shù)分別為67、13、5和3。輪紋鐮孢只有2個(gè)菌株，均來自百色市靖西市，未檢測(cè)到該基因。

M：DNA Marker。a：F. verticillioides的FUM1檢測(cè)FUM1 detection of F. verticillioides。b：FGSC的DON和NIV檢測(cè)DON and NIV detection of FGSC；1：F. graminearum；2、3：F. asiaticum；4—12：F. meridionale。C：FGSC的15-ADON檢測(cè) 15-ADON detection of FGSC；1：F. graminearum；2、3：F. asiaticum；4—12：F. meridionale

對(duì)南方鐮孢、亞洲鐮孢、亞洲鐮孢、變紅鐮孢和九州鐮孢進(jìn)行毒素化學(xué)型檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表4。共檢測(cè)出4種毒素化學(xué)型，即NIV、DON+15DON、15-ADON和NIV+15-ADON。利用引物對(duì)Tri13F/ Tri13R，可同時(shí)鑒定NIV（415 bp）和DON（234 bp）化學(xué)型（圖3-b），35個(gè)菌株中，有25個(gè)菌株具有產(chǎn)NIV毒素潛力，分別為亞洲鐮孢3個(gè)，南方鐮孢10個(gè)，九州鐮孢10個(gè)，變紅鐮孢2個(gè)。只有禾谷鐮孢菌株P(guān)ingguo4具有產(chǎn)DON毒素潛力。利用引物對(duì)Tri315F/Tri315R可鑒定15-ADON（864 bp）（圖3-c），35個(gè)菌株中，有15個(gè)菌株具有產(chǎn)15-ADON潛力，分別為禾谷鐮孢1個(gè)，亞洲鐮孢1個(gè)，南方鐮孢10個(gè)，變紅鐮孢1個(gè)，九州鐮孢2個(gè)。12個(gè)菌株同時(shí)具有產(chǎn)NIV和15-ADON潛力，其中亞洲鐮孢1個(gè)，南方鐮孢8個(gè)，九州鐮孢2個(gè)，變紅鐮孢1個(gè)。

1個(gè)禾谷鐮孢菌株具有產(chǎn)DON和15-ADON潛力；1個(gè)亞洲鐮孢具有產(chǎn)NIV和15-ADON潛力，2個(gè)亞洲鐮孢只具有產(chǎn)NIV潛力；8個(gè)南方鐮孢具有產(chǎn)NIV和15-ADON潛力，2個(gè)只具有產(chǎn)NIV潛力，2個(gè)只具有產(chǎn)15-ADON潛力；2個(gè)九州鐮孢具有產(chǎn)NIV和15-ADON潛力，8個(gè)九洲鐮孢只具有產(chǎn)NIV潛力；1個(gè)變紅鐮孢具有產(chǎn)NIV和15-ADON潛力，1個(gè)只具有產(chǎn)NIV潛力。所有菌株均未檢測(cè)到3-ADON。結(jié)果表明，NIV是禾谷鐮孢復(fù)合種、九州鐮孢和變紅鐮孢最主要的潛在毒素化學(xué)型，NIV和15-ADON是廣西玉米穗腐病禾谷鐮孢復(fù)合種最主要的潛在毒素化學(xué)型（表4）。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，由于栽培制度、氣候特點(diǎn)的差異，各地區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌并不完全一致，我國多以擬輪枝鐮孢或禾谷鐮孢復(fù)合種為優(yōu)勢(shì)致病菌[16]。然而，廣西地區(qū)由于其特殊的生態(tài)環(huán)境，該地區(qū)玉米穗腐病的致病鐮孢種群構(gòu)成具有一定獨(dú)特性。本研究結(jié)果顯示，除擬輪枝鐮孢外，層出鐮孢、九州鐮孢和南方鐮孢分離頻率也較高，而禾谷鐮孢分離頻率較低，這與我國其他生態(tài)區(qū)優(yōu)勢(shì)鐮孢菌構(gòu)成存在較大的差異。本研究并未分離到亞粘團(tuán)鐮孢，亞粘團(tuán)鐮孢在冷涼地區(qū)更常見[13]，我國陜西、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北、甘肅等地區(qū)玉米染病籽粒上分離到該鐮孢菌[2,16]，而分離到形態(tài)學(xué)上與亞粘團(tuán)鐮孢相似的甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢[12]。甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢過去曾被記錄為亞粘團(tuán)鐮孢，本研究還將所有菌株序列與亞粘團(tuán)鐮孢如AF160289.1（菌株NRRL22016）等構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明甘蔗鐮孢、輪紋鐮孢與亞粘團(tuán)鐮孢三者位于獨(dú)立的群組。Hsuan等[17]從馬來西亞玉米腐爛籽粒中分離到甘蔗鐮孢。本研究經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，接種甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢均能導(dǎo)致玉米穗腐病的發(fā)生，再分離菌株與接種菌株的形態(tài)學(xué)特征一致，本研究為國內(nèi)首次報(bào)道甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢是玉米穗腐病的致病菌。甘蔗鐮孢分布于印度、菲律賓等熱帶地區(qū)[18]，可以引起甘蔗鞘腐病、枯萎病[12]，甘蔗鐮孢和輪紋鐮孢可能與廣東和廣西香蕉冠腐病相關(guān)[19]。

表4 鐮孢菌菌株的毒素化學(xué)型檢測(cè)

擬輪枝鐮孢能在不同環(huán)境條件下引起玉米穗腐病的發(fā)生和伏馬毒素積累[9,11,20-23]。除了2個(gè)輪紋鐮孢菌株，其余4個(gè)藤倉鐮孢復(fù)合種均不同程度地檢測(cè)到，共在88個(gè)菌株中檢測(cè)到了該基因，其中以優(yōu)勢(shì)擬輪枝鐮孢檢出率最高，作為伏馬毒素合成的關(guān)鍵基因，該基因的存在與否很大程度上決定著伏馬毒素是否產(chǎn)生，Covarelli等[24]在分離的所有意大利擬輪枝鐮孢中均能檢測(cè)到，但部分菌株并未檢測(cè)到伏馬毒素；Duan等[5]研究結(jié)果顯示，來自我國18個(gè)?。ㄊ校┑?2個(gè)擬輪枝鐮孢菌株均能檢測(cè)到，其中3個(gè)菌株未檢測(cè)到伏馬毒素；Glenn等[25]研究表明，部分?jǐn)M輪枝鐮孢菌不產(chǎn)生伏馬毒素是由于的變異或伏馬毒素合成基因的缺失，例如菌株NRRL25059缺失、、和。本研究所獲得的3個(gè)擬輪枝鐮孢分離物沒有檢測(cè)到，因此，為了明確擬輪枝鐮孢等藤倉鐮孢復(fù)合種能否產(chǎn)生伏馬毒素，還需要進(jìn)行毒素定量檢測(cè)。與其他4個(gè)藤倉鐮孢復(fù)合種不同，2個(gè)輪紋鐮孢菌株均未檢測(cè)出，表明這2個(gè)菌株不具有產(chǎn)伏馬毒素的能力，事實(shí)上，輪紋鐮孢主要產(chǎn)生白僵菌毒素和恩鐮孢菌素[26]。

本研究中，禾谷鐮孢復(fù)合種和九州鐮孢為次優(yōu)勢(shì)鐮孢菌，變紅鐮孢較少。廣西禾谷鐮孢復(fù)合種構(gòu)成與我國東北地區(qū)和黃淮海地區(qū)差異較大，與我國西南地區(qū)的種群構(gòu)成更為相近。秦子慧等[16]研究表明，我國禾谷鐮孢分布廣泛，南方鐮孢主要分布于云南、貴州及陜西商洛等南方生態(tài)區(qū)；周丹妮等[4]研究表明，重慶及周邊地區(qū)的禾谷鐮孢復(fù)合種由南方鐮孢和亞洲鐮孢構(gòu)成，其中南方鐮孢為優(yōu)勢(shì)種。本研究中禾谷鐮孢復(fù)合種由南方鐮孢、亞洲鐮孢和禾谷鐮孢3個(gè)獨(dú)立種構(gòu)成。九州鐮孢作為一個(gè)較新的種[27]，近年來已被報(bào)道是玉米穗腐病致病菌[5]，在本研究中分離頻率較高，分布于廣西不同區(qū)域的7個(gè)縣。變紅-木賊鐮孢復(fù)合種（species complex，F(xiàn)IESC）至少包括變紅鐮孢和木賊鐮孢2個(gè)種，其中變紅鐮孢主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)[12]，本研究共鑒定出2個(gè)變紅鐮孢菌株，分離自南寧市隆安縣和百色市平果縣的春季玉米病穗。

廣西禾谷鐮孢復(fù)合種毒素化學(xué)型研究結(jié)果與前人研究相吻合，不同之處可能是由于地理氣候的不同導(dǎo)致適應(yīng)該地區(qū)的禾谷鐮孢復(fù)合種構(gòu)成的差異，并因此導(dǎo)致產(chǎn)毒類型的不同。在Yang等[28]研究中，侵染四川、重慶大麥的亞洲鐮孢，NIV產(chǎn)生菌所占比例高于80%，而Suga等[29]研究發(fā)現(xiàn)，日本的246個(gè)亞洲鐮孢菌株，70%產(chǎn)生NIV，說明亞洲鐮孢以產(chǎn)NIV為主。馬紅霞等[15]研究表明，我國北方春播區(qū)和黃淮海夏播區(qū)的禾谷鐮孢復(fù)合種主要的毒素化學(xué)型為DON和15-ADON；Duan等[5]對(duì)我國東北、黃淮海和西南玉米生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種的毒素化學(xué)型分析及毒素含量測(cè)定結(jié)果表明，禾谷鐮孢的主要毒素化學(xué)型為15-ADON，南方鐮孢是NIV型菌株，主要來源于西南玉米區(qū)，其中部分南方鐮孢同時(shí)產(chǎn)生NIV和15-ADON；Zhou等[30]對(duì)重慶市及周邊地區(qū)的研究結(jié)果類似。本研究中禾谷鐮孢復(fù)合種產(chǎn)NIV和15-ADON菌株較多，是由于南方鐮孢分離頻率較高的緣故。Sampietro等[31]研究顯示，在阿根廷溫帶和亞熱帶區(qū)檢測(cè)到的單端孢霉烯族類毒素的化學(xué)型存在種的特異性，其中禾谷鐮孢只產(chǎn)DON型（溫帶），南方鐮孢和布氏鐮孢為產(chǎn)NIV型（亞熱帶）。AOKI等[27]采用的九州鐮孢菌株具有產(chǎn)NIV能力，Thrane等[32]研究發(fā)現(xiàn)九州鐮孢具有產(chǎn)NIV和恩鏈霉素的能力，本研究中10個(gè)九州鐮孢菌株具有產(chǎn)NIV的潛力。變紅鐮孢具有產(chǎn)白僵菌素、單端孢霉烯族類毒素能力[12]，本研究中兩個(gè)菌株均具有產(chǎn)NIV潛力，其中一個(gè)還具有產(chǎn)15-ADON潛力。

玉米穗腐病在廣西各玉米主產(chǎn)市（縣）均有不同程度的發(fā)生，高溫、高濕、多雨的環(huán)境氣候?yàn)椴∠x侵染玉米提供了良好的條件，穗腐病已成為玉米生產(chǎn)上的重要問題。筆者項(xiàng)目組近年來調(diào)查了廣西玉米主產(chǎn)區(qū)穗腐病的自然發(fā)生情況并采集發(fā)病果穗，鐮孢菌穗腐病在各玉米主產(chǎn)縣份均有發(fā)生，以藤倉鐮孢復(fù)合種引起的穗腐病數(shù)量更多，由禾谷鐮孢復(fù)合種、九州鐮孢引起的單端孢霉烯族毒素危害也不容忽視。穗腐病在偏冷涼山區(qū)危害重于平原地區(qū)。引起鐮孢穗腐病的玉米穗部害蟲在本地區(qū)主要有玉米螟、桃蛀螟和棉鈴蟲等，玉米螟和桃蛀螟發(fā)生率低于棉鈴蟲，但是引發(fā)可見穗腐病癥狀的概率卻遠(yuǎn)高于棉鈴蟲，這是由于棉鈴蟲體型較大以危害花絲為主。在不同地點(diǎn)，害蟲和鐮孢菌種群對(duì)不同玉米品種果穗的影響并不一致，這是由于品種的抗性、栽培方式以及適宜鐮孢菌生長的溫度、濕度等多因素造成的。因此，在玉米品種選育過程中，需要選育兼抗玉米螟和不同鐮孢菌的自交系和品種，以減少鐮孢菌的感染，從而降低真菌毒素污染。

玉米穗腐病遺傳抗性的利用將有利于減少玉米產(chǎn)量損失、農(nóng)藥施用量和真菌毒素污染，然而，廣西本體玉米育種機(jī)構(gòu)極為缺乏優(yōu)異的抗穗腐病自交系，且不具有抗穗腐病接種鑒定技術(shù)。目前，我國在進(jìn)行玉米品種和自交系的抗穗腐病鑒定過程中，普遍采用擬輪枝鐮孢或禾谷鐮孢進(jìn)行接種鑒定，擬輪枝鐮孢作為廣西玉米穗腐病優(yōu)勢(shì)致病鐮孢可以作為病原菌進(jìn)行接種鑒定，但禾谷鐮孢在廣西分布極少，層出鐮孢、九州鐮孢和南方鐮孢分布較多，致病性測(cè)定表明禾谷鐮孢復(fù)合種中的南方鐮孢對(duì)玉米果穗致病能力強(qiáng)，對(duì)人畜毒性更重，需要持續(xù)關(guān)注，因此，禾谷鐮孢在廣西地區(qū)不適宜作為抗穗腐病的接種體使用，應(yīng)考慮采用致病能力強(qiáng)和產(chǎn)毒能力強(qiáng)的南方鐮孢進(jìn)行接種鑒定。除擬輪枝鐮孢和南方鐮孢外，抗源篩選還需兼顧層出鐮孢和九州鐮孢的抗性，以選擇出更適應(yīng)本區(qū)域的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

廣西21個(gè)縣（區(qū)）的138個(gè)單孢分離物鑒定為10種鐮孢菌，其中擬輪枝鐮孢為優(yōu)勢(shì)致病菌，禾谷鐮孢復(fù)合種、層出鐮孢和九州鐮孢為次優(yōu)勢(shì)致病菌，而甘蔗鐮孢則是首次報(bào)道引起玉米穗腐病。擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、甘蔗鐮孢、藤倉鐮孢均不同程度地檢測(cè)到，廣西禾谷鐮孢復(fù)合種的主要毒素化學(xué)型為NIV和15-ADON，變紅鐮孢和部分九州鐮孢的毒素化學(xué)型為NIV。廣西地區(qū)玉米種質(zhì)資源抗源篩選應(yīng)主要考慮擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、九州鐮孢和南方鐮孢的抗性，以選擇出更適應(yīng)本區(qū)域的種質(zhì)資源。

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Composition ofSpecies Causing Maize Ear Rot and Analysis of Toxigenic Chemotype in Guangxi

DU Qing1, TANG ZhaoLei1, LI ShiChu1, SHANGGUAN LingLing2, LI HuaJiao2, DUAN CanXing3

(1Institute of maize research, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007;2Guangxi Agricultural Vocational and Technical College, Nanning 530007;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081)

【】The objective of this study is to clarify the composition and toxigenic chemotype ofspecies causing maize ear rot in Guangxi, and to provide important guidance and theoretical basis for comprehensive control of maize ear rot and reasonable distribution of varieties and resistance breeding.【】The diseased ear samples were collected from main maize producing areas in Guangxi between 2016 and 2018, a total of 138 isolates from 21 counties (districts) were obtained by tissue separation and single-spore purification.species were identified and determined according to morphological characteristics and molecular methods. The phylogenetic tree was constructed based ongene sequences, and specific primers were used to detect toxigenic chemotype.【】A total of 10species were identified and confirmed among 138 isolates, including,,,,,,,,and, with the isolation frequencies of 50.72%, 12.32%, 10.87%, 8.70%, 6.52%, 3.62%, 3.62%, 1.45%, 1.45% and 0.72%, respectively.species complex (FGSC) containedthree independent species, i.e.,and.was the predominant pathogen, FGSC,andwere the secondary predominant pathogens.were the first reported to be the pathogen of maize ear rot in China. The key generesponsible for the biosynthesis of fumonisins was detected among 67, 13, 5and 3strains, respectively, which indicated the potential ability of producing fumonisins.was not detected in thestrains. Four toxigenic chemotypes including NIV, 15-ADON, NIV+15-ADON and DON+15-ADON were detected among FGSC,andstrains. Strains containing NIV chemotype included 8, 2, 2, and 1. Strains containing 15-ADONchemotype included 2. The NIV+15-ADONchemotype was detected among 821and 1strains. Only 1strain carried DON+15-ADON chemotype. The 3-ADON chemotype was not detected among these strains.【】is the predominant pathogen of maize ear rot in Guangxi.FGSC,andare the secondary predominant species.was detected among,,andThe main toxigenic chemtype of FGSC in Guangxi is NIV+15-ADON, while NIV is the main toxigenic chemotype ofand some.The population composition ofspecies causing maize ear rot in Guangxi is different from equivalent study of temperate zone in China, which may be due to the fact thatspecies adapt to the high temperature and humidity growth environment in tropical and subtropical Guangxi and thus leads to the differences of toxigenic chemotypes.

maize; ear rot;spp.; isolation frequency; toxigenic chemotype

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.005

2019-02-19；

2019-03-21

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0200705）、農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用專項(xiàng)（2018NWB036-12）、廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA17204050-2）、廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所科技發(fā)展基金（桂玉科2017003）

杜青，E-mail：duq82@163.com。通信作者段燦星，E-mail：duancanxing@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）