固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測定藤茶中11種真菌毒素*

萬青，肖凌，聶晶，胡敏，王文清，方建國

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，湖北省藥品質(zhì)量檢測與控制工程技術(shù)研究中心，武漢 430075)

真菌毒素(mycotoxin)是產(chǎn)毒真菌在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸、致突變和肝腎、生殖系統(tǒng)損害等毒性作用[1-3]。近年來，中藥材真菌毒素安全性問題引起了國內(nèi)外高度重視。中藥材基質(zhì)復(fù)雜，種植、生產(chǎn)、流通的全過程周期較長，控制不當易受多種真菌毒素污染[4-6]。目前，國內(nèi)中藥材受黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)污染較普遍，其他中藥材中常見真菌毒素還有赭曲霉毒素(ochratoxin A，OTA)、伏馬毒素(fumonisin)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)類毒素等[4]，2015年版《中華人民共和國藥典》僅收錄了遠志、大棗、肉豆蔻等19種中藥材黃曲霉毒素限度檢查[7]。為更好控制中藥材質(zhì)量，進一步提高中藥安全性，建立靈敏、快速、準確的多種真菌毒素同時檢測方法十分必要。

經(jīng)典真菌毒素檢測方法有薄層色譜法[8-9]、免疫化學(xué)法[10-12]和高效液相色譜法[13-16]等。薄層色譜法操作復(fù)雜，靈敏度和準確度欠佳，僅作為初篩使用。免疫化學(xué)法靈敏度和專屬性大大增強，具有耗時短、攜帶方便等優(yōu)勢，多作為現(xiàn)場即時檢測使用，但因其存在非特異性結(jié)合問題，不適合多種真菌毒素同時檢測，大規(guī)模應(yīng)用受到限制。液相色譜法作為《中華人民共和國藥典》2015年版推薦方法之一，是真菌毒素定量分析的常用方法，通常搭載熒光檢測器以獲得更高靈敏度。但因其衍生化方式不同、完全依賴色譜分離，無法實現(xiàn)多種真菌毒素同時檢測，且基質(zhì)干擾可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法克服了上述缺點，該方法結(jié)合了色譜分離和離子選擇的強大能力，可實現(xiàn)多成分同步檢測，在保持高靈敏度性能的同時具有良好的耐用性和穩(wěn)定性，是目前主流的真菌毒素檢測法[17-20]。

藤茶由葡萄科植物顯齒蛇葡萄Ampellosisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang的嫩莖葉加工而成，具有清熱解毒、利濕消腫功效。在我國廣西、福建、貴州、湖南和湖北等地區(qū)廣泛用于風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、濕熱黃疸、目赤腫痛、癰腫瘡癤、便赤等[21-26]。藤茶的傳統(tǒng)加工過程主要包括殺青、揉捻、渥堆、干燥等工藝[27]，渥堆過程操作不當極易受到真菌毒素污染，但筆者尚未見到有關(guān)藤茶真菌毒素檢測的報道。為全面評估藤茶安全性，筆者通過親水-親脂平衡(hydrophilic-lipophilic balence，HLB)固相萃取柱凈化，聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立了藤茶中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、伏馬毒素B1(funioccisin B1，F(xiàn)B1)、FB2、OTA、ZEN、嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)和T-2毒素(T-2)等11種真菌毒素的檢測方法，以期為同時測定藤茶中多種真菌毒素提供參考，也為探索其他中藥基質(zhì)中真菌毒素的檢測提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC 30A-4500 Q-trap型液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津公司)；ST16R型高速冷凍離心機(德國賽默飛世爾公司)；P-12型平行蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；AH-30型全自動均質(zhì)器(美國睿科公司)；XP-204型電子分析天平(感量：0.1 mg，梅特勒-托利多公司)，Milli-Q 純水儀(美國密理博公司)。

1.2試劑 黃曲霉毒素混合對照品溶液(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2濃度分別為0.93，0.30，0.93，0.35 μg·mL-1，批號：610001-201804)購自中國食品藥品檢定研究院；FB1(50 μg·mL-1，批號：1H01J23)，F(xiàn)B2(50 μg·mL-1，批號：1H01J23)，AFM1(10 μg·mL-1，批號：1I00A11)，T-2毒素(100 μg·mL-1，批號：1H00I14)，DON(100 μg·mL-1，批號：1H01B10)，ZEN(25 μg·mL-1，批號：1K00H29)，OTA(10 μg·mL-1，批號：1H01B14)均購自青島普瑞邦生物工程有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，醋酸銨為質(zhì)譜純，水為超純水。

1.3樣品 49批藤茶樣品信息見表1，樣品由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部方建國教授鑒定，均為顯齒蛇葡萄Ampellosisgrossedentata(Hand.-Mazz.) W.T.Wang的炮制品。

表1 藤茶樣品信息Tab.1 Information of Ampellosis grossedentata (Hand.-Mazz.) W.T.Wang samples

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 美國菲羅門Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以5 mmol·L-1醋酸銨(pH值3.0)(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫[0～5 min，10%B；>5～6 min，10%B→20%B；>6～30 min，20%B→45%B；>30～35 min，45%B→10%B]；流速為0.2 mL·min-1，柱溫30 ℃。進樣量4 μL[28-29]。

2.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(electrospray ionization source，ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)，正、負兩種模式進行掃描[28-29]，各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2，對照品及樣品總離子流圖見圖1。

表2 11種真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry parameters of 11 mycotoxins

2.3混合對照品溶液的配制 分別精密吸取上述對照品適量，加甲醇配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、FB1、FB2、T-2毒素、ZEN、OTA以及DON濃度依次為46.5，30，46.5，35，100，50，50，600，75，100，2 000 ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.4供試品溶液的制備 取藤茶粉末[過三號篩，篩孔內(nèi)徑(355±13)μm，50目]約5 g，精密稱定，置均質(zhì)瓶，精密加入80%乙腈溶液100 mL，均質(zhì)器上提取45 s，8 000 r·min-1離心20 min(r=10 cm)，精密量取上清液20 mL，置50 mL量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取稀釋后的溶液20 mL，減壓濃縮至約5 mL，放冷，離心，孔徑0.22 μm濾膜濾過，緩慢通過已經(jīng)活化好的固相萃取柱(依次用甲醇和水各5 mL淋洗活化)，直至空氣進入柱子，先用純化水5 mL淋洗，再用甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，于平行蒸發(fā)儀上濃縮至近干，用50%甲醇轉(zhuǎn)移并定容至2 mL，放冷，離心，孔徑0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.5線性關(guān)系與靈敏度考察 為考察基質(zhì)效應(yīng)對方法靈敏度的影響，將上述混合對照品溶液分別用空白基質(zhì)和50%甲醇稀釋成系列混合標準工作液，以峰面積對各個真菌毒素的質(zhì)量濃度作線性回歸，繪制標準曲線。采用公式(1)對基質(zhì)效應(yīng)進評估[2，30]。

A.混合對照品溶液正離子模式總離子流圖；B.混合對照品溶液負離子模式總離子流圖；C.供試品溶液正離子模式總離子流圖；D.供試品溶液負離子模式總離子流圖；1.AFM1；2.AFG2；3.AFG1；4.AFB2；5.AFB1；6.FB1；7.FB2；8.T-2；9.DON；10.OTA；11.ZEN。圖1 混合對照品及供試品溶液總離子流圖A.Total ion current chromatogram of mixed reference solution in positive ion mode；B.Total ion current chromatogram of mixed reference solution in negative ion mode；C.Total ion current chromatogram of test solution in positive ion mode；D.Total ion current chromatogram of test solution in negative ion mode；1.Aflatoxin M1；2.Aflatoxin G2；3.Aflatoxin G1；4.Aflatoxin B2；5.Aflatoxin B1；6.Fumonisin B1；7.Fumonisin B2；8.T-2 Toxin；9.Deoxynivalenol；10.Ochratoxin A；11.Zearalenone.Fig.1 Total ion current chromatograms of mixed reference and test solutions

ME(%)=Ais/Ai

(1)

公式(1)中，Ais為空白提取液系列標準曲線的斜率；Ai為50%甲醇系列標準曲線的斜率，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，AFB1、AFB2、AFG1、T-2、DON等均有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，AFM1、FB1、FB2則表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)。

圖2 基質(zhì)抑制效應(yīng)(A)和基質(zhì)增強效應(yīng)(B)Fig.2 The inhibition(A) and enhancement effect (B) of matrix

為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，分別精密量取上述混合對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置5 mL量瓶，加空白基質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，各進樣4 μL，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以定性離子對的3倍信噪比(S/N)確定化合物的檢出限，定量離子對的10倍信噪比確定化合物的定量限，結(jié)果見表3。

表3 11種真菌毒素線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.3 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LQDs of 11 mycotoxins

2.6加樣回收率實驗 取同一批藤茶粉末[過三號篩，篩孔內(nèi)徑(355±13) μm]5 g，精密稱定，按低、中、高濃度水平分別精密加入混合對照品溶液1，2，4 mL，每個濃度平行3份，按照“2.4”項方法制備供試品溶液進樣檢測，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 11種真菌毒素回收率實驗結(jié)果Tab.4 Recovery results of 11 mycotoxins n=3

2.7重復(fù)性實驗 取藤茶粉末[過三號篩，篩孔內(nèi)徑(355±13) μm]5 g，精密稱定，共6份。分別精密加入混合對照品溶液1 mL，按“2.4”項方法制備供試品溶液并測定濃度，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好，見表5。

表5 11種真菌毒素重復(fù)性實驗結(jié)果Tab.5 Repeatability results of 11 mycotoxins n=6

2.8穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于配制后0，2，4，8，12，24 h進樣測定，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、FB1、FB2、T-2毒素、ZEN、OTA以及DON峰面積的RSD (n=6)分別為4.19%，6.03%，4.60%，3.64%，3.53%，1.55%，7.24%，7.44%，7.95%，2.23%和4.48%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9樣品測定 采用所建立的方法分別測定49批藤茶樣品中真菌毒素，其中湖北省10批，福建省9批，重慶市2批，湖南省10批，貴州省4批，廣西壯族自治區(qū)13批，江西省1批。49批樣品中11種真菌毒素均未檢出。

3 討論

真菌毒素常見的提取方式有振搖法、超聲法以及高速均質(zhì)法。振搖法提取耗時較長，提取效率低；超聲法提取易發(fā)熱，且雜質(zhì)溶出較多。筆者在本研究采用均質(zhì)法提取，使樣品組織和提取溶劑在高速旋轉(zhuǎn)時充分接觸，可快速、簡單、高效提取出真菌毒素[17]。實驗比較了不同濃度甲醇和乙腈的真菌毒素提取效果，結(jié)果顯示：樣品采用80%乙腈提取時，基質(zhì)效應(yīng)影響最小，11種真菌毒素均能達到較好回收率，故選用80%乙腈作為提取溶劑。

固相萃取法是真菌毒素檢測中常用的非特異性凈化方法，本實驗采用waters Oasis HLB 型固相萃取小柱，可以滿足多成分的提取凈化要求，但其保留機制為反相，需要調(diào)整上樣溶液的極性，將提取溶劑80%乙腈置換成水，才會使目標物在固相萃取小柱上得以保留。藤茶主要含有黃酮類化學(xué)成分，其中二氫楊梅素含量最高，為30%～40%[31]，二氫楊梅素易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，在常溫或冷水中溶解度較低。在溶劑置換過程中，二氫楊梅素不斷沉淀析出，對真菌毒素的富集凈化有一定的影響。經(jīng)過反復(fù)實驗，最終采用80%乙腈溶液提取，加水稀釋后取20 mL減壓濃縮至約5 mL，放冷，離心，孔徑0.22 μm濾膜濾過后，再緩慢通過已經(jīng)活化好的固相萃取柱處理樣品，各真菌毒素回收率為69.82%～118.77%。

《中華人民共和國藥典》2015年版[7](一部)規(guī)定了黃曲霉毒素在中藥材中的最高限量標準，即AFB1不得高于5 μg·kg-1，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總量不得高于10 μg·kg-1，但并未制定其他毒素的限量標準。GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定AFB1、AFM1、DON、OTA和ZEN等真菌毒素在谷物、豆類、乳制品及堅果等食物中的限量，但未提及茶葉類制品的限量標準。然而，國內(nèi)已有學(xué)者在普洱茶、紅茶、綠茶等茶葉中檢出了AFB2、AFG1、和FB1、FB2等[32-34]。雖然本次收集的49批藤茶樣品均未檢出上述11種真菌毒素，可能是干燥環(huán)節(jié)殺滅了藤茶中大多數(shù)微生物，但目前全國各地的藤茶加工尚無規(guī)范統(tǒng)一標準，大部分地區(qū)仍以手工小作坊為主，其渥堆過程中溫濕度掌握不當，或干燥后在包裝、運輸和貯藏過程中吸潮，仍可能霉變產(chǎn)生真菌毒素。本研究建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定藤茶中11種真菌毒素的方法，可快速完成中藥中常見真菌毒素的定性和定量分析，具有簡單快速、準確靈敏、實用性強的特點，為開展藤茶產(chǎn)地加工及貯存過程中的真菌毒素風(fēng)險評估提供了技術(shù)支持。