清瘟敗毒顆粒的薄層鑒別分析

李艷玲，李向輝，趙建平，劉永錄，張遠(yuǎn)方，張貴方

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450011)

清瘟敗毒散是清代著名溫病學(xué)家余師愚所創(chuàng)制的名方[1]，由石膏、知母、黃連、黃芩、赤芍、牡丹皮、連翹、梔子等十四味中藥組成，是《中華人民共和國(guó)獸藥典》每版均收載的成方制劑[2]。該方主治熱毒發(fā)斑、高熱神昏，臨床廣泛用于多種病原微生物感染引起的畜禽疑難雜癥的治療[3-6]。清瘟敗毒顆粒是在散劑的基礎(chǔ)上改制而來(lái)?，F(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》清瘟敗毒散標(biāo)準(zhǔn)，除對(duì)部分藥材顯微鑒別外，只對(duì)方中的黃連進(jìn)行了薄層定性鑒別。為建立該顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制顆粒劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)制劑中的赤芍、梔子、玄參進(jìn)行了薄層鑒別。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清瘟敗毒顆粒由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院提供( 批號(hào)20170731) ；梔子苷(批號(hào)：110749-200714 ，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；玄參對(duì)照藥材(110325-200627，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；赤芍苷(121148-200715，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；石膏、知母、黃芩、赤芍、黃連、牡丹皮、桔梗、連翹、梔子、淡竹葉、地黃、甘草等飲片均購(gòu)于江蘇、湖北、安徽等地，經(jīng)河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院制藥工程學(xué)院趙建平高級(jí)獸醫(yī)師檢驗(yàn)，均符合2015版《中國(guó)獸藥典》( 二部) 項(xiàng)下相關(guān)要求和規(guī)定。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

分析天平(上海醫(yī)用激光儀器廠)；KQ-200KDE超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 赤芍的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的配制

取清瘟敗毒顆粒樣品8 g，加乙醇100 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙醚洗滌3次，每次15 mL，棄去乙醚液，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解。加中性三氧化二鋁0.5 g，水浴上攪勻，干燥，加在中性三氧化二鋁柱上(100-200目，2 g，內(nèi)徑1-1.5 cm)，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，標(biāo)記為供試品溶液。

2.1.2 陰性對(duì)照液的配制

稱(chēng)取缺赤芍的清瘟敗毒顆粒8 g，在研缽中研磨成細(xì)粉，然后按照供試品溶液的制備方法制成缺赤芍的陰性對(duì)照液。

2.1.3 赤芍苷標(biāo)準(zhǔn)品的配制

稱(chēng)取赤芍苷標(biāo)準(zhǔn)品0.002 g，加2 mL甲醇制成含赤芍苷1 mg/ml的溶液，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.4 鑒別方法

用毛細(xì)管分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照液和赤芍苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板的同一直線(xiàn)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(305100.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，以檢視赤芍陰性、樣品、赤芍苷標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 赤芍鑒別薄層圖譜1.清瘟敗毒顆粒(缺赤芍)陰性； 2.清瘟敗毒顆粒樣品； 3.赤芍苷標(biāo)準(zhǔn)品

從圖1可以明顯看出，清瘟敗毒顆粒樣品在與赤芍苷標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的位置有相同顏色的斑點(diǎn)，而缺赤芍的陰性樣品沒(méi)有。說(shuō)明此方法可以定性鑒別出清瘟敗毒顆粒中的赤芍。

2.2 梔子的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的配制

稱(chēng)取清瘟敗毒顆粒18 g，在研缽中研磨成細(xì)粉，加40 mL甲醇，超聲處理30 min，靜置過(guò)濾后將濾液蒸干，給殘?jiān)铀?0 mL溶解，用水飽和的正丁醇溶液振搖提取2次，每次20 mL，合并提取過(guò)的正丁醇溶液，將溶液蒸干后的殘?jiān)蛹状?20 mL，最后將其在中性氧化鋁柱子上(120目，6g，內(nèi)徑2 cm)洗脫，收集洗脫液并將其濃縮至2 mL，標(biāo)記為供試品溶液。

2.2.2 陰性對(duì)照液的配制

稱(chēng)取缺少梔子的清瘟敗毒顆粒18 g，在研缽中研磨成細(xì)粉，然后按照供試品溶液的制備方法制成缺梔子的陰性對(duì)照液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱(chēng)取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品0.002 g，加2 mL甲醇制成含梔子苷1 mg/mL的溶液，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.4 鑒別方法

分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液各4 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(550.6)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以顯色劑(5%的香草醛硫酸溶液)，將薄層板置于105 ℃下恒溫至出現(xiàn)清晰斑點(diǎn)。自然光下觀察薄層板，在供試品色譜中，與梔子苷在距離點(diǎn)樣處相同位置出現(xiàn)了相同顏色的清晰斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品在此位置沒(méi)有顯示任何斑點(diǎn)。說(shuō)明此方法可以定性鑒別出清瘟敗毒顆粒中的梔子。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 清瘟敗毒顆粒中梔子的TLC圖(噴過(guò)顯色劑)1.清瘟敗毒顆粒(缺梔子)陰性；2.清瘟敗毒顆粒樣品；3.梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品

圖3 清瘟敗毒顆粒中梔子的TLC圖(105℃加熱后)1.清瘟敗毒顆粒(缺梔子)陰性；2.清瘟敗毒顆粒樣品3.梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品

2.3 玄參的薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液的配制

取清瘟敗毒顆粒樣品6 g，加60%乙醇80 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解。加中性三氧化二鋁0.5 g，水浴上攪勻，干燥，加在中性三氧化二鋁柱上(100-200目，2 g，內(nèi)徑1-1.5 cm)，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?5%乙醇1 mL使溶解，標(biāo)記為供試品溶液。

2.3.2 陰性對(duì)照液的配制

稱(chēng)取缺玄參的清瘟敗毒顆粒6 g，按照以上供試品溶液的制備方法處理，標(biāo)記為缺玄參的陰性對(duì)照液。

2.3.3 玄參對(duì)照藥材的配制

取玄參對(duì)照藥材0.5 g，加乙醇50 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，水液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干，殘?jiān)?5%乙醇1 mL，標(biāo)記為玄參對(duì)照藥材溶液。

2.3.4 鑒別方法

用毛細(xì)管分別吸取供試品溶液、陰性對(duì)照液和玄參對(duì)照藥材溶液，分別點(diǎn)在同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-水(410.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，檢視玄參陰性、樣品、對(duì)照藥材溶液。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 玄參鑒別薄層圖譜1.清瘟敗毒顆粒(缺玄參)陰性； 2.清瘟敗毒顆粒樣品； 3.玄參對(duì)照藥材

從圖4可以看出，清瘟敗毒顆粒樣品與玄參對(duì)照藥材在相同位置有同一顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品沒(méi)有斑點(diǎn)與玄參對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)。說(shuō)明此方法可以定性鑒別出清瘟敗毒顆粒中的玄參。

3 討論

薄層色譜法是將固定相涂在玻璃板上，均勻涂布，然后點(diǎn)樣、展開(kāi)，再依據(jù)比移值(Rf)與適宜的對(duì)照品按同樣方法得到的色譜比移值做比對(duì)，對(duì)藥物進(jìn)行鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定的方法。其原理是利用藥物中的各種成分對(duì)薄層板上的吸附劑的吸附能力不一樣，連續(xù)做出吸附、解吸、再吸附、再解吸的行為，進(jìn)而達(dá)到分離各成分的目的[7]。薄層色譜法主要應(yīng)用于藥物的定性鑒別，如本文中定性鑒別清瘟敗毒顆粒中赤芍、梔子和玄參。另外，薄層色譜法還可用于藥物的質(zhì)量控制和雜質(zhì)檢查，如檢查藥物中的雜質(zhì)限量；進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程控制，對(duì)反應(yīng)副產(chǎn)物和中間體做出分析；探索色譜分離條件，如分離時(shí)選用何種吸附劑；對(duì)脂質(zhì)類(lèi)采用薄層色譜 (TLC) 和柱氣相色譜法測(cè)定等。薄層色譜分析可應(yīng)用于所有化學(xué)成分如碳水化合物、苯酚、木質(zhì)素和萃取物等[8]。影響薄層色譜分析的因素有很多，比如薄層版制備技巧、點(diǎn)樣方法、展開(kāi)劑的選擇、展開(kāi)劑的飽和等。

對(duì)梔子的提取方法，參照文獻(xiàn)[9]中清瘟敗毒顆粒梔子苷的提取方法，用甲醇超聲，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液，結(jié)果顯示陰性有干擾。又用丙酮進(jìn)行超聲提取，陰性仍然存在干擾。經(jīng)查閱藥典、文獻(xiàn)，反復(fù)優(yōu)化提取方法，最后確定為用甲醇超聲，并用正丁醇萃取作為供試液，同時(shí)將樣品過(guò)三氧化鋁柱子，成功將干擾去除。另外，文獻(xiàn)[9]介紹以乙酸乙酯 -丙酮 -甲酸 -水( 10720．5) 為展開(kāi)劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，自 100 ℃開(kāi)始加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，于自然光下檢測(cè)梔子苷的存在。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，展開(kāi)劑加甲酸后斑點(diǎn)明顯拖尾，于是把甲酸去除，并進(jìn)一步調(diào)整了展開(kāi)劑中試劑的比例，最后確定展開(kāi)劑用乙酸乙酯-丙酮-水(550.6)，梔子苷斑點(diǎn)清晰、圓整度好。

清瘟敗毒散藥味繁多，其散劑是原藥材粉末直接入藥，可用顯微鑒別法鑒別各藥材成分。清瘟敗毒顆粒是清瘟敗毒散改變劑型的新產(chǎn)品。顆粒劑是飲片經(jīng)過(guò)提取后制成的劑型，沒(méi)有了原藥材粉末，不具備散劑的原始藥材結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，故不能使用顯微鑒別法。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了清瘟敗毒顆粒中赤芍、梔子和玄參的薄層鑒別研究，三種藥材的鑒別結(jié)果均斑點(diǎn)清晰、專(zhuān)屬性強(qiáng)，較好地反映了清瘟敗毒顆粒中赤芍、梔子和玄參的質(zhì)量要求，為清瘟敗毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。