適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉的檢測方法優(yōu)化

文/張洪元 陶文兵 楊薇

優(yōu)化適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉的檢測方法 // 由于水解蛋白的水溶性，給多個檢測項(xiàng)目帶來了挑戰(zhàn)，如樣品前處理沉淀不完全、難以過濾、濾液混濁、色譜圖中出現(xiàn)干擾峰，等等。本文分析了水解蛋白的特性，從樣品前處理、色譜峰識別、色譜條件（流動相pH、濃度）、色譜柱沖洗等方面對以上項(xiàng)目檢測方法的優(yōu)化，展示了一些成功的例子，提供了一些解決方案。

乳是嬰兒理想的天然食品，牛乳是嬰兒首選的乳代品。牛乳雖然營養(yǎng)豐富，但它與母乳相比在蛋白組成上酪蛋白含量偏高，母乳中乳清蛋白含量為60%，酪蛋白含量為40%，而牛奶中酪蛋白含量占80%，乳清蛋白含量僅為20%。此外，其他營養(yǎng)成分如β乳球蛋白、β酪蛋白等含量存在差異。正是由于這些差異，導(dǎo)致了部分嬰兒對配方乳粉的過敏反應(yīng)。已有研究表明，高溫高壓、酶水解、糖基化反應(yīng)等均能降低牛乳的過敏性，而適度水解蛋白是降低嬰兒配方乳粉致敏性的最有效可行的方法，被推薦作為嬰幼兒過敏預(yù)防的早期膳食干預(yù)方法。所以，水解蛋白配方乳粉已成為一種趨勢。

目前，市面上已有不少水解蛋白配方乳粉出現(xiàn)，此類配方乳粉的檢測需求也越來越大。由于適度水解蛋白為較小片段的蛋白或小分子多肽，與未酶解的大分子蛋白相比，其具有更好的水溶性。采用國標(biāo)方法檢測適度水解蛋白乳粉時，部分檢測項(xiàng)目（主要是水溶性維生素）遇到了挑戰(zhàn)，如樣品沉淀蛋白后難以過濾，色譜圖中出現(xiàn)干擾峰，等等。查詢國內(nèi)外文獻(xiàn)，本文特針對這些問題，提出了一些解決方案。

樣品前處理的優(yōu)化

使用沉淀劑沉淀配方乳粉中的蛋白，并過濾除去（或離心分離），是分析水溶性維生素或其余水溶性組分時除去蛋白干擾的主要方法。目前現(xiàn)行有效的國標(biāo)方法中，測試項(xiàng)目維生素C、左旋肉堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、?；撬帷⒛憠A、亞硝酸鹽與硝酸鹽、三聚氰胺均采用了此法。

但是，由于適度水解蛋白的存在，處理適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品時，往往會出現(xiàn)沉淀不完全的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為沉淀稀松，成膠體狀，在過濾樣品溶液時，堵塞濾紙，過濾速度慢，濾液不澄清，有白色渾濁。

使用玻璃纖維濾紙（如Whatman 934 AH），可有效解決這個難題。玻璃纖維濾紙各向同性好、孔徑分布均勻，具有流速高，納污能力強(qiáng)的特點(diǎn)，并可以過濾細(xì)小的顆粒。與其他的纖維材料和人工合成材料相比，玻璃纖維濾紙過濾效率更高，納污能力更強(qiáng)。使用玻璃纖維濾紙后，可有效防止濾紙堵塞，維持較快的過濾速度，同時保持濾液澄清，避免干擾后續(xù)分析操作。

色譜峰識別的優(yōu)化

圖1 優(yōu)化前?；撬嶙V圖。

圖2 優(yōu)化后?；撬嶙V圖。

圖3 優(yōu)化前硝酸鹽譜圖。

圖4 優(yōu)化后硝酸鹽譜圖。

測定分析適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品時，由于適度水解蛋白的水溶性，在沉淀蛋白步驟中未被完全除去，殘存的水解蛋白會與分析物一同注入色譜體系中進(jìn)行檢測分析，并作為雜峰被檢出。部分雜峰的保留時間接近分析物，會影響分析物的保留行為，導(dǎo)致分析物主峰漂移，干擾分析物的定性，造成結(jié)果誤判。因此，需要采取措施對色譜峰識別進(jìn)行優(yōu)化，確保定性的準(zhǔn)確性。

加標(biāo)定性

加標(biāo)定性是一個簡單易行的解決方案。在測試樣品中加入相同水平的標(biāo)準(zhǔn)分析物，進(jìn)樣分析，比較加標(biāo)前后分析物的峰面積變化比率是否與加標(biāo)量相符，以此確保色譜峰識別的正確性。

峰純度檢測

檢測過程中，有時雜峰與分析物保留時間完全重合，其表象為：色譜峰形正常，但加標(biāo)后峰面積未同比增加，測試結(jié)果顯著高于理論值。遇到此類情形，需考慮是否有某一雜質(zhì)與分析物同時出峰。

此時，可采用峰純度檢測。使用二極管陣列檢測器（DAD）全波長掃描色譜峰，如峰純度低于閾值（一般可選0.990），則該峰為混合峰，需要優(yōu)化色譜分析條件以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步分離，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

色譜峰分離的優(yōu)化

測定分析適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品時，一些雜峰與分析物保留時間相近，未實(shí)現(xiàn)基線分離，影響了分析物的定量，如維生素B6、?；撬?、硝酸鹽。此時，便需要優(yōu)化色譜分析條件，提高定量準(zhǔn)確度。

流動相pH優(yōu)化

水溶性維生素多采用離子對試劑實(shí)現(xiàn)色譜分離，故流動相的pH將極大的影響分析物在色譜柱上的保留能力，影響出峰時間。

圖5 優(yōu)化前煙酰胺譜圖。

圖6 優(yōu)化后煙酰胺譜圖。

利用分析物與干擾物電離能力的微小差異，通過調(diào)整流動相的pH，可改變分析物與干擾物的相對保留時間，實(shí)現(xiàn)基線分離，提高定量的準(zhǔn)確度。

如使用國標(biāo)GB5009.169—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法分析測定適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉中的?；撬帷Ｎ醋髡{(diào)整前，分析物有雜峰干擾，主峰無分離度，基線也有漂移，強(qiáng)制垂直切分，無法確保結(jié)果的準(zhǔn)確度，如圖1所示。

只調(diào)整流動相pH，由4.2降為4.1，雜峰保留時間延長，與分析物?；撬釋?shí)現(xiàn)了基線分離，基線也相對平緩，分離度為2.11，定量結(jié)果準(zhǔn)確度改善，如圖2所示。

流動相濃度優(yōu)化

離子色譜法是利用被測物質(zhì)的離子性進(jìn)行分離和檢測的液相色譜法。離子色譜淋洗液的濃度是影響分析物保留時間的重要因素。調(diào)整淋洗液濃度，將實(shí)現(xiàn)反相液相色譜中調(diào)整有機(jī)相比例同樣的效果，改變分析物與干擾物的相對保留時間，實(shí)現(xiàn)分離的目的。

如國標(biāo)GB5009.33—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第一法離子色譜法測定適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉中的硝酸鹽。優(yōu)化前，分析物與雜峰未基線分離，強(qiáng)制垂直切分后定量結(jié)果不準(zhǔn)確，如圖3所示。

調(diào)整淋洗液濃度，由5 mmol/L 13 min, 11 mmol/L 9 min, 50 mmol/L 5 min, 5 mmol/L 7 min改為5 mmol/L 13 min, 9 mmol/L 9 min, 50 mmol/L 5 min, 5 mmol/L 7 min，降低了中間KOH淋洗液濃度，雜峰保留時間延后，與主峰硝酸鹽實(shí)現(xiàn)了基線分離，分離度達(dá)到了1.83，提高了定量準(zhǔn)確度，如圖4所示。

色譜柱沖洗

由于適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，在進(jìn)行色譜分析時，分析物主峰之后可能還有大量的雜質(zhì)峰。它們的保留能力各不相同，有些雜峰可能具有極強(qiáng)的保留能力，如果色譜運(yùn)行時間沒有足夠長，其可能在下一針中出峰，影響樣品定量。因此，需確保色譜運(yùn)行足夠時間，或提高有機(jī)相濃度，保證高保留物質(zhì)的洗脫。

如國標(biāo)GB 5009.89-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中煙酸和煙酰胺的測定》第二法高效液相色譜法測定適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉中的煙酸和煙酰胺，未優(yōu)化前，前一針樣品的高保留物質(zhì)與下一針樣品中的煙酰胺一同出峰，嚴(yán)重干擾了定量的準(zhǔn)確性，如圖5所示。

在分析物主峰出峰后，增大有機(jī)相甲醇比例，同時延長色譜運(yùn)行時間，沖洗出雜質(zhì)峰，再恢復(fù)初始流動相并平衡，解決了雜峰干擾，如圖6所示。

結(jié)論

本文分析了適度水解蛋白嬰幼兒配方乳粉樣品測試分析時遇到的困難和挑戰(zhàn)，并依據(jù)不同問題提供了解決方案和思路，重點(diǎn)介紹了液相色譜分析時通過小幅調(diào)整流動相pH、濃度等，優(yōu)化分析測試結(jié)果的準(zhǔn)確性。 ■