非小細(xì)胞肺癌勞拉替尼獲得性耐藥細(xì)胞株的建立及耐藥后治療策略

邱英 周娟 杜豆 馬灝川 紀(jì)佳朋 張為民，

1 廣東藥科大學(xué)（廣州510006）；2中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤科（廣州510010）

棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated proteinlike 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是EML4-ALK 融合基因陽(yáng)性晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療。從2011年第一代ALK-TKI 克唑替尼獲得FDA 批準(zhǔn)上市到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第三代勞拉替尼。克唑替尼一線治療EML4-ALK 陽(yáng)性NSCLC的ORR 為74%，中位PFS 達(dá)10.9 個(gè)月［1］。二、三代ALK-TKIs 艾樂(lè)替尼、勞拉替尼等在克唑替尼耐藥及初治人群中均顯示出良好的療效［2-3］，但最終都會(huì)發(fā)生耐藥［4-5］。發(fā)現(xiàn)并克服ALK-TKIs 耐藥是目前EML4-ALK 陽(yáng)性晚期NSCLC 治療面臨的重要問(wèn)題，遺憾的是雖然一代ALK-TKI 克唑替尼的耐藥機(jī)制較明確，第三代ALK-TKI 勞拉替尼的耐藥機(jī)制未闡明，發(fā)現(xiàn)勞拉替尼耐藥機(jī)制并克服其耐藥是臨床重大課題。

體外建立耐藥細(xì)胞用于模擬臨床患者的獲得性耐藥，是研究耐藥機(jī)制的主要手段之一［6］。目前國(guó)內(nèi)外建立了一代ALK-TKI 克唑替尼和二代ALK-TKI 艾樂(lè)替尼耐藥細(xì)胞系［7-8］，以及一線使用三代ALK-TKI 勞拉替尼耐藥細(xì)胞系［7］，但尚無(wú)在克唑替尼耐藥基礎(chǔ)上建立勞拉替尼耐藥細(xì)胞系的相關(guān)研究。為探索二線使用勞拉替尼的耐藥機(jī)制，本研究選用EML4-ALK 融合基因陽(yáng)性、對(duì)克唑替尼耐藥的肺癌細(xì)胞SNU-2535，予以逐步遞增勞拉替尼劑量法建立獲得性耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR，探討其耐藥機(jī)制，并探討是否存在逆轉(zhuǎn)其耐藥的治療策略及耐藥后對(duì)不同化療藥物敏感性的差異，為臨床勞拉替尼耐藥后選擇合適的治療策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 人NSCLC 原發(fā)性克唑替尼耐藥細(xì)胞株SNU-2535 購(gòu)自美國(guó)Creative bioarray 公司。勞拉替尼、克唑替尼、APR-246 粉末制劑購(gòu)于美國(guó)Selleck 公司，順鉑、紫杉醇、培美曲塞、吉西他濱、多西他賽購(gòu)自MCE 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本Dojindo 公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)MP 公司，ALK 一抗、兔二抗均購(gòu)自美國(guó)CST 公司，β-actin一抗購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司，免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑ECL 購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及勞拉替尼耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR 的建立 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和密度更換培養(yǎng)液或傳代。采用逐步遞增藥物濃度法建立獲得性耐藥細(xì)胞株，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-2535 細(xì)胞，以500 nmol/L勞拉替尼為初始濃度處理細(xì)胞，24 h 后更換培養(yǎng)液，去除凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及代謝產(chǎn)物，避免對(duì)活細(xì)胞造成傷害，待細(xì)胞耐受并穩(wěn)定生長(zhǎng)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1∶2 傳代，倍增藥物濃度，最終細(xì)胞能夠耐受16 μmol/L 勞拉替尼，并在終濃度下維持培養(yǎng)1 個(gè)月，歷時(shí)7 個(gè)月成功建立了勞拉替尼耐藥細(xì)胞株，將其命名為SNU-2535 LR。

1.3 CCK-8 法 檢測(cè)SNU-2535 LR 細(xì)胞的勞拉替尼耐藥性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-2535、SNU-2535 LR 細(xì)胞，按每孔4 000 個(gè)細(xì)胞密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的勞拉替尼，對(duì)SNU-2535 細(xì)胞起始濃度10 μmol/L，依次3 倍稀釋共6 個(gè)濃度梯度，對(duì)SNU-2535 LR 細(xì)胞起始濃度100 μmol/L，依次10 倍稀釋共6 個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸去上清，每孔分別加入RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL 和CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)孵育2 h 后檢測(cè)450 nm 處OD值，用Graphpad Prism 7.0 軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50和耐藥指數(shù)（RI），RI=IC50（SNU-2535 LR）/IC50（SNU-2535）。

檢測(cè)耐藥前后細(xì)胞對(duì)克唑替尼的敏感性：具體操作和計(jì)算方法同上，對(duì)SNU-2535 細(xì)胞克唑替尼起始濃度30 μmol/L，依次3 倍稀釋共6 個(gè)濃度梯度，對(duì)SNU-2535 LR 細(xì)胞起始濃度10 μmol/L，依次10 倍稀釋共6 個(gè)濃度梯度。

檢測(cè)APR-246 對(duì)SNU-2535 LR 細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用：具體操作和計(jì)算方法同上，測(cè)P53蛋白激動(dòng)劑APR-246對(duì)SNU-2535 LR細(xì)胞增殖的抑制作用時(shí)，APR-246 起始濃度為100 μmol/L，依次10 倍稀釋共6 個(gè)濃度梯度。聯(lián)合APR-246 和勞拉替尼時(shí)，將APR-246 濃度固定在5 μmol/L（小于APR-246 單藥IC50值），勞拉替尼起始濃度為100 μmol/L，依次10 倍稀釋共5 個(gè)濃度梯度，計(jì)算出聯(lián)合IC50值。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC50（勞拉替尼單藥）/IC50（APR-246 與勞拉替尼聯(lián)用）。

檢測(cè)SNU-2535、SNU-2535 LR 細(xì)胞對(duì)不同化藥物的敏感性：具體操作和計(jì)算方法同上，所有藥物依次10 倍稀釋共5 個(gè)濃度梯度，不同藥物對(duì)不同細(xì)胞選用的藥物濃度梯度有所不同，具體分組如下：順鉑組、培美曲塞組、吉西他濱組兩株細(xì)胞起始濃度分別為1 000、100、10 μmol/L；紫杉醇組SNU-2535 LR 細(xì)胞起始濃度為10 μmol/L，SNU-2535細(xì)胞起始濃度為100 μmol/L；多西他賽組SNU-2535 LR 細(xì)胞起始濃度為1 μmol/L，SNU-2535 細(xì)胞起始濃度為100 μmol/L。

1.4 二代測(cè)序（NGS）檢測(cè)細(xì)胞ALK及其它相關(guān)基因突變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNU-2535、SNU-2535 LR細(xì)胞消化離心棄上清后，用1 mL PBS 重懸后置于4 ℃冰盒中，送燃石醫(yī)學(xué)公司行NGS 技術(shù)檢測(cè)肺癌相關(guān)168 基因突變情況。

1.5 Western Blot分析相關(guān)蛋白的表達(dá) SNU-2535與SNU-2535 LR 細(xì)胞加入裂解液，置于冰上裂解后提取蛋白并測(cè)定濃度，等量上樣后行8% SDSPAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，按適當(dāng)比例加入相應(yīng)的一抗（按說(shuō)明書(shū)稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，再加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床反應(yīng)1 h，TBST 洗膜3 次，最后用ECL 顯色并采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，應(yīng)用Graphpad Prism 7.0 軟件作圖，SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR 的建立 歷時(shí)7 個(gè)月成功在體外構(gòu)建勞拉替尼獲得性耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR，用不含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)洗脫勞拉替尼4 個(gè)月后，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨著勞拉替尼濃度的增加，親本細(xì)胞SNU-2535 和耐藥細(xì)胞SNU-2535 LR 的存活率都逐漸降低，勞拉替尼對(duì)SNU-2535 細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于SNU-2535 LR 細(xì)胞，勞拉替尼對(duì)他們IC50值分別為（1.362±0.324）μmol/L和（46.433±9.562）μmol/L（P＜0.05），RI 為34.092，表明SNU-2535 LR 細(xì)胞顯示出明顯的勞拉替尼耐藥特征。見(jiàn)圖1A、1B。

2.2 耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR ALK及其他相關(guān)基因突變變化 NGS 檢測(cè)結(jié)果顯示，SNU-2535 細(xì)胞EML4-ALK 融合基因陽(yáng)性，且合并ALK p.G1269A點(diǎn)突變（克唑替尼耐藥繼發(fā)突變基因）；耐藥細(xì)胞SNU-2535 LR 較親本細(xì)胞SNU-2535 EML4-ALK豐度（55.45%vs.28.37%）及ALK p.G1269A 豐度（34.46%vs.0）顯著降低，新出現(xiàn)TP53 突變，豐度接近100%，未提示ALK 激酶域的繼發(fā)突變、融合基因擴(kuò)增。

2.3 耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR 的EML4-ALK 相關(guān)蛋白表達(dá)變化 Western Blot 結(jié)果顯示，與親本細(xì)胞SNU-2535 比較，耐藥細(xì)胞SNU-2535 LR 的EML4-ALK V1、EML4-ALK V3 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR 對(duì)克唑替尼敏感性的變化 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，克唑替尼對(duì)耐藥細(xì)胞SNU-2535 LR 的IC50值為（4.726 ± 1.056）μmol/L，與親本細(xì)胞（1.211 ± 0.033）μmol/L 相比，明顯升高（P＜0.05）。表明相對(duì)親本細(xì)胞，耐藥細(xì)胞不僅對(duì)勞拉替尼敏感性下降，對(duì)克唑替尼的敏感性也明顯下降。見(jiàn)圖1C、1D。

2.5 APR-246 對(duì)SNU-2535 LR 細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用 APR-246（5 μmol/L）聯(lián)合不同濃度的勞拉替尼作用于SNU-2535 LR 細(xì)胞，勞拉替尼的IC50值為（9.738 ± 0.548）μmol/L。與未加APR-246 處理時(shí)的（46.433 ± 9.562）μmol/L 相比，勞拉替尼對(duì)SNU-2535 LR 細(xì)胞的IC50 值明顯下降（P＜0.05），說(shuō)明聯(lián)合APR-246 和勞拉替尼可以部分恢復(fù)SNU-2535 LR 細(xì)胞對(duì)勞拉替尼的敏感性，起到逆轉(zhuǎn)耐藥作用，計(jì)算得耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為4.768。見(jiàn)圖1E、1F。

圖1 不同抑制劑對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線Fig.1 The growth inhibition curves of different inhibitors in SNU-2535 and SNU-2535 LR cells

圖2 Western Blot 檢測(cè)SNU-2535、SNU-2535 LR 細(xì)胞EML4-ALK 相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.2 The expressions of EML4-ALK-related proteins inSNU-2535 and SNU-2535 LR cells

2.6 耐藥細(xì)胞株對(duì)不同化療藥物敏感性變化 耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR 對(duì)吉西他濱、多西他賽、紫杉醇敏感性均優(yōu)于順鉑和培美曲塞（P＜0.05），其中多西他賽最為敏感。對(duì)比親本細(xì)胞，耐藥細(xì)胞株SNU-2535 LR 對(duì)吉西他濱、多西他賽、紫杉醇的敏感性明顯提高（P＜0.05），對(duì)順鉑的敏感性下降（P＜0.05）；對(duì)培美曲塞敏感性均較差，不可比較。見(jiàn)表1。

表1 SNU-2535 和SNU-2535 LR 細(xì)胞對(duì)不同化療藥物IC50值Tab.1 The IC50 values of different chemotherapeutic drugs in SNU-2535 and SNU-2535 LR cells ±s

表1 SNU-2535 和SNU-2535 LR 細(xì)胞對(duì)不同化療藥物IC50值Tab.1 The IC50 values of different chemotherapeutic drugs in SNU-2535 and SNU-2535 LR cells ±s

注：*表示與SNU-2535細(xì)胞比，IC50值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；#P 值無(wú)法計(jì)算

IC50值紫杉醇（nmol/L）多西他賽（nmol/L）吉西他濱（μmol/L）順鉑（μmol/L）培美曲塞（μmol/L）SNU-2535 29 266.667±4 435.147 31 256.667±4 212.010 2.036±0.206 61.820±16.385＞100 SNU-2535 LR 0.305±0.146*0.021±0.013*0.173±0.041*278.833±40.092*＞100#

3 討論

本研究選取NSCLC 克唑替尼原發(fā)性耐藥細(xì)胞SNU-2535，經(jīng)NGS 檢測(cè)證實(shí)EML4-ALK 融合基因陽(yáng)性且合并ALK p.G1269A突變，通過(guò)藥物濃度遞增法構(gòu)建勞拉替尼獲得性耐藥細(xì)胞系SNU-2535 LR，隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞對(duì)勞拉替尼的敏感性逐漸降低，最終產(chǎn)生了顯著的耐藥，RI為34.092，提示體外首次在伴G1269A 突變的克唑替尼耐藥基礎(chǔ)上成功建立勞拉替尼耐藥細(xì)胞模型。

為進(jìn)一步對(duì)SNU-2535 LR 細(xì)胞的耐藥機(jī)制進(jìn)行探討，筆者對(duì)耐藥前后細(xì)胞行NGS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EML4-ALK 豐度明顯降低，ALK p.G1269A 突變消失，未出現(xiàn)ALK 激酶域的二次突變或融合基因擴(kuò)增等；通過(guò)Western Blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SNU-2535 LR細(xì)胞EML4-ALK 融合基因相關(guān)蛋白EML4-ALK V1、EML4-ALK V3 表達(dá)下降；此外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SNU-2535 LR 細(xì)胞勞拉替尼、克唑替尼敏感性均相對(duì)親本細(xì)胞下降。以上結(jié)果表明ALK靶點(diǎn)減少可能是第三代ALK-TKI 獲得性耐藥的主要機(jī)制之一，與國(guó)外既往報(bào)道結(jié)果一致。ISOZAKI等［9］通過(guò)建立艾樂(lè)替尼獲得性耐藥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)耐藥細(xì)胞系EML4-ALK 融合基因消失；YODA 等［5］對(duì)臨床勞拉替尼耐藥后的患者行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分患者無(wú)繼發(fā)突變，原有ALK 耐藥突變位點(diǎn)的消失。這些結(jié)果表明ALK 靶點(diǎn)減少導(dǎo)致的獲得性耐藥繼續(xù)使用ALK-TKIs 時(shí)效果不佳。

有研究提示p53 蛋白激活劑APR-246，能將突變型p53 蛋白重新折疊成野生型構(gòu)象，從而誘導(dǎo)突變型p53 蛋白細(xì)胞凋亡［10］。本研究中耐藥細(xì)胞系新出現(xiàn)TP53 突變，且豐度較高。所以本研究選用APR-246 嘗試逆轉(zhuǎn)SNU-2535 LR 耐藥，聯(lián)用5 μmol/L APR-246 后，勞拉替尼對(duì)SNU-2535 LR 的IC50值明顯下降，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為4.768，提示聯(lián)合APR-246可逆轉(zhuǎn)耐藥。以上結(jié)果表明TP53突變可能是第三代ALK-TKIs 獲得性耐藥的機(jī)制之一。GAINOR等［4］對(duì)臨床二代ALK-TKI 耐藥患者進(jìn)行二次活檢發(fā)現(xiàn)，56%病理標(biāo)本出現(xiàn)新的基因改變，其中TP53是最主要的突變基因，但該研究耐藥前未對(duì)標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，未能明確TP53 基因突變的產(chǎn)生能否導(dǎo)致耐藥。而本研究證實(shí)了TP53 基因是勞拉替尼耐藥后新出現(xiàn)的最主要突變基因，且聯(lián)合P53 蛋白激活劑能逆轉(zhuǎn)耐藥。

勞拉替尼作為最新一代ALK-TKI，能克服一、二代抑制劑耐藥，使肺癌患者從中獲益［11］，其耐藥將使得ALK 靶向治療陷入困境。針對(duì)勞拉替尼耐藥后對(duì)不同治療性藥物的敏感性如何，目前暫沒(méi)有臨床大樣本研究報(bào)道，在勞拉替尼獲得性耐藥株的基礎(chǔ)上探索耐藥后治療具有重要意義。本研究提示勞拉替尼耐藥后發(fā)生TP53 突變時(shí)，聯(lián)用P53 蛋白激活劑APR-246 能逆轉(zhuǎn)耐藥，這為臨床勞拉替尼耐藥合并TP53 突變患者的治療提供了一個(gè)新的方向。此外，本研究還探討了勞拉替尼耐藥后對(duì)臨床常用化療藥物的敏感性，提示耐藥細(xì)胞株對(duì)吉西他濱、多西他賽、紫杉醇敏感性均優(yōu)于順鉑和培美曲塞，其中多西他賽最為敏感，而且相對(duì)耐藥前對(duì)吉西他濱、多西他賽、紫杉醇的反應(yīng)明顯增強(qiáng)，可為臨床勞拉替尼耐藥患者后續(xù)化療方案的選擇提供一定的指導(dǎo)。

綜上所述，本研究首次成功在克唑替尼耐藥基礎(chǔ)上建立勞拉替尼耐藥細(xì)胞模型，并發(fā)現(xiàn)EML4-ALK 融合基因豐度下降及TP53 突變可能是其耐藥機(jī)制之一。此外還發(fā)現(xiàn)，P53 蛋白激動(dòng)劑聯(lián)合勞拉替尼可為臨床勞拉替尼耐藥合并TP53 突變患者提供一個(gè)新的治療方向；勞拉替尼耐藥后繼續(xù)化療時(shí)可以嘗試選擇吉西他濱、多西他賽、紫杉醇。雖然對(duì)本研究為臨床勞拉替尼耐藥患者的后續(xù)治療策略選擇提供了理論支撐，但仍需要擴(kuò)大樣本在動(dòng)物及臨床中加以證實(shí)。