長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

張科科，耿玉東

口腔鱗狀細(xì)胞癌 （Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部惡性腫瘤的常見類型，易發(fā)生局部浸潤(rùn)性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且患者預(yù)后較差， 術(shù)后 5年生存率約為 50%［1，2］。因此尋找OSCC的治療靶點(diǎn)，并探討OSCC發(fā)生發(fā)展及遷移侵襲的分子機(jī)制對(duì)于提高OSCC患者術(shù)后生存率具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度大于200bp且無編碼功能的RNA分子，具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine upregulated geue 1，TUG1） 是一種重要的lncRNA，在胃癌［3］、食管癌［4］及骨肉瘤［5］等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移侵襲等密切相關(guān)［6，7］。 目前關(guān)于 TUG1 在 OSCC 發(fā)生發(fā)展中的作用的研究較少，該研究檢測(cè)TUG1在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)，并沉默TUG1的表達(dá)分析其對(duì)OSCC細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響，初步探討其在OSCC中的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑人的正常口腔角質(zhì)細(xì)胞株（hOK）和人口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-25細(xì)胞株均購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，脂質(zhì)體lipofectamine 2000和Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，siRNA及相關(guān)引物由北京擎科生物科技有限公司合成，MMP-2、MMP-9及VEGF-C一抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將hOK和SCC-25細(xì)胞株接種于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的PRMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-PCR使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量及純度分析。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。采用 qPCR儀 （Applied Biosystems 7600型，ABI，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算細(xì)胞中TUG1的相對(duì)表達(dá)量，相關(guān)引物設(shè)計(jì)見表1。

表 1 引物序列表

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SCC-25細(xì)胞，按照1×104/孔的濃度接種到96孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照l(shuí)iporfectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分別將siRNA陰性對(duì)照（si-NC）序列和 TUG1 siRNA（si-TUG1）序列轉(zhuǎn)染至SCC-25細(xì)胞中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染24 h后，將SCC25細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100 μl，并設(shè)5個(gè)復(fù)孔， 分別培養(yǎng) 24、48、72、96 h 后， 加入 10 μl CCK-8溶液，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀上檢測(cè)各樣品450 nm處的吸光度值（A值）。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲分別用Transwell小室和Transwell預(yù)涂覆基質(zhì)膠小室進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞懸浮液100 μl加入小室的上室中，將 600 μl含有 10%FBS的PRMI-1640培養(yǎng)基或 100 μl稀釋后的 Matrigel基質(zhì)膠均勻加到下室中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定遷移到下室的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，洗凈晾干后，倒置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白。DAB檢測(cè)濃度后，采用SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，用含有5%脫脂奶粉的PBS溶液室溫封閉 1 h，加入 VEGF-C、MMP-2、MMP-9 及β-actin 一抗（1∶2000），4 ℃孵育過夜。 洗膜后，加入二抗 IgG（1∶2000），室溫孵育 1 h。 采用電化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，采用軟件Image J進(jìn)行圖像分析。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUG1在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)SCC25細(xì)胞中 TUG1-1的表達(dá)水平（2.43±0.44）明顯高于hOK細(xì)胞（1.13±0.31），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.167，P=0.014）。

2.2 siRNA干擾SCC25細(xì)胞中TUG1-1的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾后 SCC25細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和si-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且 si-TUG1-3的干擾效果最佳，見表2，因此選用si-TUG1-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表 2 轉(zhuǎn)染不同siRNA序列對(duì)SCC25細(xì)胞中TUG1表達(dá)的影響

2.3 沉默TUG1對(duì)SCC25細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48、72及96 h后，si-TUG1組SCC25細(xì)胞的吸光度值明顯低于對(duì)照組和si-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），表明沉默TUG1能抑制SCC25細(xì)胞的增殖能力。

圖 1 轉(zhuǎn)染siRNA后，SCC25細(xì)胞的增殖活性

2.4 沉默TUG1對(duì)SCC25細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Transwell法檢測(cè)結(jié)果見圖2（見封三），結(jié)果顯示，si-TUG1組中細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量明顯低于對(duì)照組和si-NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），同時(shí)Western blot檢測(cè)遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，si-TUG1組中 MMP-2、MMP-9和VEGF-C蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和si-NC組（P＜0.05），提示沉默 TUG1能夠抑制SCC25細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖2見封三。

圖 3 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

目前l(fā)ncRNA已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。盡管lncRNA不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但其能夠在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面調(diào)控下游目標(biāo)基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、脂質(zhì)代謝、疾病的發(fā)生及免疫調(diào)節(jié)等多種生理病理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，可作為腫瘤早期診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療的靶點(diǎn)［8-10］。

研究證實(shí)，lncRNA TUG1在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等行為密切相關(guān)［11-14］。 趙筱倩等［15］研究發(fā)現(xiàn) TUG1 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，與腫瘤直徑、TNM分期明顯相關(guān)，沉默TUG1可顯著抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外該研究還發(fā)現(xiàn)沉默TUG1可上調(diào)抑癌基因p27的表達(dá)水平，提示TUG1可能是通過下調(diào)抑癌基因p27的表達(dá)來促進(jìn)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Hu等［16］研究發(fā)現(xiàn)TUG1在宮頸癌組織和4個(gè)宮頸癌細(xì)胞系中均顯著上調(diào)，TUG1高表達(dá)與腫瘤體積、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且沉默TUG1能激活細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。Gao等［17］研究表明過表達(dá)TUG1能促進(jìn)T24和EJ細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，沉默 TUG1則抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)該研究還提示TUG1可能是通過過抑制miR-29c促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Liang等［18］研究發(fā)現(xiàn)沉默TUG1的表達(dá)可以抑制Tca8113和TSCCA口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲。該研究同樣發(fā)現(xiàn)TUG1在SCC25細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，采用siRNA干擾TUG1的表達(dá)能夠抑制SCC25細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，即TUG1促進(jìn)了口腔鱗癌細(xì)胞SCC25的增殖、遷移和侵襲，在口腔鱗癌中具有癌基因的活性。該結(jié)果提示不同OSCC細(xì)胞系中TUG1均能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲。但TUG是如何調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移及其相關(guān)蛋白的表達(dá)及TUG1的作用是否受其他非編碼RNA的影響等還有待后續(xù)研究深入探討。

綜上所述，TUG1在OSCC細(xì)胞中高表達(dá)，沉默TUG1能夠抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示TUG1可能是口腔鱗癌潛在的治療靶點(diǎn)。