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    鐵觀音茶梗中揮發(fā)性物質(zhì)分析

    2019-06-20 22:38:10王蔚黃旭建林允志湯榕津郭雅玲
    熱帶作物學(xué)報 2019年5期
    關(guān)鍵詞:生物活性

    王蔚 黃旭建 林允志 湯榕津 郭雅玲

    摘? 要? 本研究以鐵觀音茶梗為供試材料,采用頂空進樣法-氣質(zhì)聯(lián)用(HS-GC/MS)技術(shù)對其揮發(fā)性物質(zhì)進行提取和檢測,利用質(zhì)譜結(jié)合保留指數(shù)對其進行定性,并對揮發(fā)物種類、相對含量及部分揮發(fā)物所具備的生物活性進行比較和探討。結(jié)果表明:從安溪鐵觀音茶梗中共檢測出130種化合物, 其中共有的成分108種;采用質(zhì)譜法(mass spectrometry, MS)完全鑒定出45種、初步鑒定出58種,采用各化合物的保留指數(shù)(retention index,RI)鑒定出54種;MS與RI相結(jié)合共完全鑒定出68種揮發(fā)物。這表明譜庫檢索與保留指數(shù)相結(jié)合,有利于提高可定性揮發(fā)物的數(shù)量以及定性的準(zhǔn)確度。在梗中,碳?xì)漕惢衔?、醛、醇、酯的種類和含量都最為豐富,相對含量高于1%的揮發(fā)物有24種,部分揮發(fā)物具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性作用,其含量占茶梗揮發(fā)物總含量的20.51%。該結(jié)果為研究茶梗在形成烏龍茶香氣品質(zhì)中所起的作用及茶梗的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞? 安溪鐵觀音;茶梗;HS-GC/MS;揮發(fā)物;生物活性

    中圖分類號? S571.1? ? ? 文獻標(biāo)識碼? A

    Abstract? The tea stem of Anxi Guanyin was taken as the research object and the volatile substances of stem were extracted and analyzed by headspace sampling-gas chromatography/mass spectrometry (HS-GC/MS). Its qualitative analysis was achieved by mass Spectrometry (MS) combined with retention index (RI). The type and relative content of the volatiles and the biological activity of some volatiles were compared and discussed. 130 compounds were detected in the tea stem of Anxi Guanyin, of which 108 were in common. 45 compounds were totally identified and 58 compounds were preliminarily identified by MS, while 54 compounds were identified by RI. 68 compounds were totally identified by MS combined with RI, meaning the combination of MS and RI greatly improved the quantity of qualitative volatiles and accuracy of quality. The types and contents of hydrocarbons, aldehydes, alcohols and esters were the most abundant in the stem. There were 24 volatiles with relative content higher than 1%. Some volatiles, whose content accounted for 20.51% of the total volatile content of tea stem, had biological activities, such as anaesthesia, bacteriostasis, anticancer and et al. The study would provide a theoretical basis for the role of the tea stem in the formation of aroma quality of Oolong tea and the comprehensive utilization of tea stems.

    Keywords? Anxi Guanyin tea; tea stem; HS-GC/MS; volatiles; biological activity

    DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.019

    制作烏龍茶的鮮葉要求具有一定的成熟度,因而茶青中不僅有葉片,還含有較多的梗。茶梗是一種特殊的可再生生物資源[1],盡管含有相當(dāng)數(shù)量的香氣物質(zhì),但由于茶梗影響茶葉的美觀,同時其茶堿含量偏高,口味較為苦澀,因此,往往被揀出。茶葉加工每年都有大量的茶梗副產(chǎn)品,約占毛茶總重的20%,如果能合理利用,可增加茶葉生產(chǎn)過程的經(jīng)濟效益[2-3]。

    茶梗與茶葉所含的芳香性物質(zhì)和抗氧化性物質(zhì)的組成相似。芳香物質(zhì)不僅影響茶葉的品質(zhì),而且也影響茶樹本身及被飲用者的生理代謝。前人研究發(fā)現(xiàn)香氣可以調(diào)節(jié)精神狀態(tài),具有抗菌[4]、鎮(zhèn)靜[5]、止痛[6]、消炎[7]、抗抑郁抗焦慮[8-9]、抗疲勞[10]等作用。因此,茶梗中的揮發(fā)性物質(zhì)可以作為天然的食品添加劑、藥用保健成分、化妝品原料等,從而提高茶產(chǎn)品的附加值。

    目前已有學(xué)者對茶梗的揮發(fā)性物質(zhì)進行了研究。謝清桃等[1]采用同時蒸餾萃取法提取鐵觀音茶梗浸膏揮發(fā)性成分,用GC/MS法分離鑒定出58種揮發(fā)性成分,并將浸膏用于卷煙加香,能夠明顯豐富煙香,減小刺激性和改善卷煙余味。袁杰[11]采用SPME-GC/MS對茶梗的香氣和鐵觀音香氣的生物活性等進行了研究。Zeng等[12]對干燥烏龍茶樣及其茶湯的揮發(fā)物和糖苷類前體進行感官審評和生化研究,結(jié)果表明,梗中茶氨酸和揮發(fā)性單萜的積累量比葉子中更加豐富,但茉莉內(nèi)酯、吲哚和反式橙花醇含量比葉子中少,梗的存在沒有顯著改善茶樣總的香氣特征。

    鐵觀音作為閩南烏龍茶的代表,其毛茶含有較多的梗,是研究茶梗揮發(fā)物很好的實驗材料。本試驗從安溪不同產(chǎn)地收集了鐵觀音毛茶,以其梗作為研究對象,采用頂空進樣法-氣質(zhì)聯(lián)用(HS-GC/MS)技術(shù)對茶梗揮發(fā)物進行提取和檢測,對其種類、相對含量及其相關(guān)的生物活性進行了統(tǒng)計分析,以期為研究茶梗在形成烏龍茶香氣品質(zhì)中所起的作用及茶梗的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    1.1.1? 茶樣? 選取2017年秋季安溪鐵觀音毛茶樣6個,以其梗作為試驗樣并磨碎,過40目篩,裝于鋁箔袋,密封備用。

    1.1.2? 主要試劑? NaCl(分析純,≥99.5%,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司),正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品C8-C30(美國o2si公司)。

    1.1.3? 主要儀器設(shè)備? Clarus SQ8T 型氣質(zhì)聯(lián)用儀、Elite-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、TurboMatrix 40 Trap自動頂空進樣器、20 mL頂空瓶(美國Perkin Elmer公司);電子分析天平(0.0001 g,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);WK-400B高速藥物粉碎機(山東青州市精誠機械有限公司);實驗室超純水器(科爾頓水務(wù)有限公司)。

    1.2? 方法

    按課題組前期優(yōu)化的試驗參數(shù)進行操作[13]。

    1.2.1? 茶樣頂空進樣方法? 每個茶梗樣設(shè)置3個平行,準(zhǔn)確稱取0.5 g的茶梗粉(精確至0.0001 g)于20 mL頂空瓶中,加入1 mL的溶于三級水的飽和NaCl溶液,用配有聚四氟乙烯墊的密封蓋密封并按順序放入自動進樣器,以設(shè)置好的儀器參數(shù)進樣。爐溫(平衡溫度)80 ℃,取樣針溫度100 ℃,傳輸線溫度120 ℃,樣品平衡時間60 min,捕集阱Hi 280 ℃,Lo 40 ℃,保持5 min,干吹1 min,解析0.5 min,頂空瓶壓力40 psi,色譜柱壓力12 psi,解析壓力15 psi,頂空出口分流。

    1.2.2? GC-MS條件? 升溫程序:50 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至125 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,保持3 min,以15 ℃/min升至230 ℃,保持5 min。載氣為高純度 He(99.999%)。電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃,質(zhì)譜傳輸線溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍m/z 45~500。

    1.2.3? 正構(gòu)烷烴頂空進樣方法與保留指數(shù)計算? 準(zhǔn)確移取2 μL正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品,按與茶梗樣相同的頂空和GC-MS條件進樣,重復(fù)3次。記錄每個正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間,求3次重復(fù)的平均值。茶梗揮發(fā)物各組分的保留指數(shù)計算采用Kovats保留指數(shù)計算公式[14]:

    式中:RI—待測組分的保留指數(shù);RTunknown—待測組分的保留時間;RTn、RTn+1—待測組分前后正構(gòu)烷烴的保留時間。

    1.3? 數(shù)據(jù)分析

    通過檢索NIST 2011在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,核對質(zhì)譜匹配度并參考相關(guān)文獻資料[15-22],然后再從特征離子、實際成分、保留指數(shù)等方面,分別對各峰所代表的揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱加以確認(rèn)。其相對含量采用峰面積歸一法分析,即以各香氣組分的峰面積占總峰面積之比值表示組分相對含量。

    采用SPSS 21軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 安溪鐵觀音茶梗揮發(fā)性成分的定性與定量分析

    由表1可知,安溪鐵觀音茶梗檢測出來的揮發(fā)物總峰面積范圍為365 160 457~396 236 061,平均值為355 260 803,峰個數(shù)范圍為115~125,平均值為121.67。

    由表2可知,安溪鐵觀音茶梗中共檢測出130種揮發(fā)性物質(zhì),其中MS完全鑒定出45種,初步鑒定出58種,RI鑒定出54種,MS與RI相結(jié)合共完全鑒定出68種揮發(fā)物。

    6個樣品共有的芳香物質(zhì)合計108種,包括碳?xì)漕惢衔铮?3種,12.72%)、未知(22種,9.17%)、醛(14種,17.63%)、醇(10種,14.25%)、酯(6種,12.95%)、含氮化合物(5種,6.14%)、氯化物(5種,11.32%)、酮(5種,2.22%)、雜氧類(5種,7.49%)、酚(2種,0.31%)、含硫化合物(1種,2.94%)。可以看出,在梗中碳?xì)漕惢衔铩⑷?、醇、酯不管是種類還是含量都最為豐富。茶梗揮發(fā)物中相對含量高于1%的化合物有24種,其相對含量與香氣類型統(tǒng)計結(jié)果見表3。

    2.2? 安溪鐵觀音茶梗中具有生物活性的揮發(fā)性成分

    茶梗中檢測出來的部分揮發(fā)物具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性,可以直接作為藥物或者制備藥物的原料、中間體而應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。經(jīng)過檢索前人文獻,在茶梗所含的108種共有成分中,除了20種未知化合物及部分檢索不到醫(yī)藥相關(guān)理化性質(zhì)和生物活性的化合物外,課題組對剩下的茶梗揮發(fā)物進行了功能分類以及種類、相對含量的統(tǒng)計,詳見表4。

    其中茶梗中具麻醉作用的揮發(fā)物包括一氯甲烷(7.77%)、2-甲基呋喃(0.57%)和β-石竹烯(0.02%);具抑菌、抗病毒活性的揮發(fā)物有吲哚(0.79%)、D -檸檬烯(0.43%)、姜黃烯(0.0.3%)和β-石竹烯(0.0.2%)?;钚匝踝杂苫軌蛞l(fā)癌癥、自身免疫性疾病、炎癥、腫瘤、心肌與腦損傷等性

    能已被生物醫(yī)學(xué)界所證實, 因此抗氧化活性與抗癌活性密切相關(guān)[23]。茶梗中具有抗癌、抗氧化活性的揮發(fā)物有吲哚(0.79%)、D-檸檬烯(0.43%)、水楊酸甲酯(0.09%)、姜黃烯(0.03%)、β-石竹烯(0.02%)。茶梗中具有消炎抗炎活性的揮發(fā)物有γ-雪松烯(0.75%)、D-檸檬烯(0.43%)、甲基丁香酚(0.20%)、水楊酸甲酯(0.09%)、姜黃烯(0.03%)和β-石竹烯(0.02%)。茶梗中具有抗抑郁活性的揮發(fā)物有順式-β-羅勒烯(1.77%)和β-石竹烯(0.02%)。茶梗中具有鎮(zhèn)痛活性的揮發(fā)物有水楊酸甲酯(0.09%)。茶梗中具有止咳祛痰活性的揮發(fā)物有D-檸檬烯(0.43%)、甲基丁香酚(0.20%)、愈創(chuàng)木酚(0.09%)、姜黃烯(0.03%)和β-石竹烯(0.02%)。在茶梗中具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮、安眠作用的揮發(fā)物有甲基丁香酚(0.20%)、正己醇(0.14%)、β-石竹烯(0.02%)。在茶梗中不少揮發(fā)物可用作制備醫(yī)藥的原料或者中間體。包括異戊醛(2.11%)、苯甲醛(1.71%)、庚醛(1.38%)、甲基庚烯酮(1.18%)、吲哚(0.79%)、苯乙醛(0.63%)、2-甲基呋喃(0.57%)、苯乙腈(0.29%)、對二甲苯(0.25%)、順式-4-庚烯醛(0.17%)、正己醇(0.14%)、α-松油烯(0.11%)和愈創(chuàng)木酚(0.09%)。

    可見,在茶梗中有22種具有生物活性的揮發(fā)物,且不少揮發(fā)物同時兼?zhèn)涠喾N生物活性,比如D-檸檬烯具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎抗炎、止咳祛痰等一系列生物活性。這些揮發(fā)物的含量之和占茶梗揮發(fā)物總含量的18.90%~ 22.93%,平均值為20.51%。

    3? 討論

    本研究從鐵觀音茶梗中共檢測出130種揮發(fā)性物質(zhì),MS與RI相結(jié)合完全鑒定出68種揮發(fā)物,效果優(yōu)于使用單一的定性方法,因此譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)的定性方法可大大提高定性準(zhǔn)確度和可定性物質(zhì)數(shù)量。同時,因為保留指數(shù)反映的是化合物與固定相的相互作用,當(dāng)固定相相同時,這種相互作用僅與化合物的拓?fù)洹缀魏碗娦蕴卣飨嚓P(guān)[24-25],因此本研究定性結(jié)果可用于與相同實驗條件下的實驗結(jié)果進行比對。

    經(jīng)過比對前人文獻,本研究茶梗中檢測到的與鐵觀音成品茶相同的香氣成分有醋酸乙酯(6)、正己醛(18)、庚醛(35)等40種(表2中有下劃線的物質(zhì))[19, 26-29]。鐵觀音茶梗中檢測出的揮發(fā)物與鐵觀音成品茶具有相似性,這是由烏龍茶的鮮葉原料要求和加工工藝所共同決定的。制作烏龍茶的鮮葉要求具有一定的成熟度并含有一定量的梗。做青是烏龍茶的特征性工藝也是形成烏龍茶品質(zhì)特征的關(guān)鍵技術(shù),做青包括搖青與晾青,其作用分別是走水、還陽。烏龍茶香氣成分轉(zhuǎn)化和形成的重要條件和顯著特征之一是,具有一定成熟度的鮮葉在長時間做青過程中使得葉片主要在葉緣損傷變色,逐步適度失水,嫩莖中的內(nèi)含物通過“走水”輸送至葉細(xì)胞以增進香氣的形成,保證內(nèi)含物轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化的節(jié)奏。因此梗的存在對烏龍茶香氣品質(zhì)特征的形成是必須的。與茶梗中檢測到的相同成分有9種,包括正己醛(1)、苯甲醛(46)、D-檸檬烯(60)、苯乙醛(65)、順式-β-羅勒烯(66)、苯乙腈(82)、水楊酸甲酯(95)、吲哚(106)、β-紫羅蘭酮(124)[1]。部分在前人文獻中檢測到的梗所含有的香氣成分本研究沒有檢測出,此外本研究檢測出了一些前人文獻中沒有檢測到的揮發(fā)物,這可能是因為所選茶樣產(chǎn)地不同、檢測方法與條件不同以及質(zhì)譜定性能力強弱不同導(dǎo)致的差異。

    在鐵觀音茶梗中,碳?xì)漕惢衔?、醛、醇、酯不管是種類還是含量都最為豐富,其中碳?xì)漕惢衔镏械牟伙柡蜔N往往具有獨特的香型,在茶梗整體香型中所起作用更大,比如D-檸檬烯具有檸檬香,α-柏木烯具木香。醛類化合物閾值很低,對產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻較大[30]。醇類通常具有芳香或酸敗氣味,其中,不飽和醇的風(fēng)味閾值較低,對風(fēng)味貢獻較大,如多種萜醇和芳香醇[31]。酯類化合物通常呈現(xiàn)水果香味[32];有的酯類成分,如油酸甲酯、亞油酸甲酯等,它們由高級脂肪酸和低級醇脫水縮合而成,沒有氣味,對茶葉香氣形成幾乎沒有作用[28]。此外,梗揮發(fā)物共有成分中相對含量高于1%的化合物包括醋酸乙酯、一氯甲烷、1-戊烯-3-醇等24種,它們大部分具有獨特的香型。但是由于各種香氣成分對檢測器響應(yīng)校正因子各不相同,供試茶樣各類香氣成分(如醇、醛、酮等)并不具備成分間含量或類內(nèi)加和可比性。因此,不同來源茶樣某種或某些香氣成分含量的增減變化更值關(guān)注[33]。此外有些大量香氣成分對茶葉香型品質(zhì)貢獻并不很大,其中還存在感管閾值問題[34]。茶葉梗中相對含量大于1%的化學(xué)成分列于表3,這些成分雖然不一定是茶梗的特征香氣成分,但以相同的步驟檢測鐵觀音成品茶香氣成分后,可將梗與成品茶中同一物質(zhì)的相對含量或含量(以峰面積代表)作比較,不僅可為研究做茶過程中梗與茶之間香氣成分的互相轉(zhuǎn)化提供一定的參考,而且梗中這些含量較高的成分,可被提純應(yīng)用于醫(yī)藥方面以提高茶梗的附加值。

    6個茶梗樣的共有成分有108種,其中,含量18.90%~22.93%(平均值為20.51%)的揮發(fā)物可用于醫(yī)藥,具有麻醉、抑菌、抗癌等生物活性作用。但由于香氣成分總量僅占茶葉干物質(zhì)總量的0.005%~0.03%,含量極低,這些揮發(fā)物發(fā)揮麻醉、抑菌、抗癌等活性所需的最低濃度及最適濃度需要后期試驗來進一步確定。

    本研究分析了鐵觀音茶梗中所含揮發(fā)物的種類及相對含量,并統(tǒng)計分析了部分揮發(fā)物所具備的的生物活性,經(jīng)過與前人文獻比較分析,初步探究了鐵觀音茶梗的揮發(fā)物。比較梗、純茶、全茶香氣成分與感官審評之間的差異,進一步了解梗在形成烏龍茶香氣品質(zhì)中所起的作用,結(jié)合體內(nèi)和體外生物實驗探究茶梗中具生物活性的香氣提取物在醫(yī)藥中的作用是接下來的研究方向。

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