甘蔗響應(yīng)梢腐病菌侵染的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王澤平 林善海 梁強 李長寧 宋修鵬 劉璐 李毅杰

摘? 要? 本文旨在解析甘蔗響應(yīng)梢腐病菌侵染過程中的生理生化機制，為甘蔗抗梢腐病育種及病害防治提供理論指導(dǎo)和科學(xué)參考。以我國甘蔗梢腐病主要致病菌Fusarium verticillioides孢子懸浮液為病原，以高抗梢腐病品種YT94/128和高感梢腐病品種GT37為宿主材料，在溫室條件下進(jìn)行針刺法接種，提取病情指數(shù)最嚴(yán)重時期，即接種后第14天的甘蔗葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行iTRAQ定量表達(dá)分析。結(jié)果顯示，從GT37中成功鑒定3707個蛋白，獲得542個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)表達(dá)187個，下調(diào)表達(dá)355個;從YT94/128中成功鑒定到3068個蛋白，獲得差異蛋白449個，其中上調(diào)表達(dá)191個，下調(diào)表達(dá)258個。這說明遺傳背景不同的甘蔗品種在蛋白質(zhì)組成上有很大差異，推測這是不同甘蔗品種間抗梢腐病性差異的重要分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 甘蔗;梢腐病;輪枝鐮孢菌;蛋白質(zhì)組學(xué);侵染

中圖分類號? S566.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

Abstract? This study was to provide a theoretical guidance and scientific reference for sugarcane resistance breeding and disease prevention by analyzing the physiological and biochemical mechanism in the infection process of sugarcane response to pokkah boeng disease. With spore suspension of Fusarium verticillioides （the mainly pathogenic fungus of pokkah boeng disease in China） as the pathogeny and YT94/128 （HR）， GT37 （HS） as the tested materials by syringe inoculation under a greenhouse， and the samples were collected at the 14th post-inoculation with the highest disease index to carry out quantitative expression analysis by isobaric tags for relative and absolute quantitation （iTRAQ）. The results showed a total of 3707 proteins were successfully identified from GT37， and 542 differentially expressed proteins （DEPs） were obtained， of which 187 were up-regulated and 355 were down-regulated. Meanwhile， a total of 3068 proteins were successfully identified from YT94/128， and 449 DEPs were obtained， of which 191 were up-regulated and 258 were down-regulated. In a word， there are significant differences in the protein composition of sugarcane varieties with different genetic backgrounds， and it is speculated that this is the important molecular basis for the difference of resistance on pokkah boeng disease between different sugarcane varieties.

Keywords? sugarcane; pokkah boeng disease; Fusarium verticillioides; proteomic; infection

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.015

甘蔗梢腐?。╬okkah boeng disease）是由鐮刀菌（Gibberella fujikuroi）引起的，在我國蔗區(qū)其主要病原為Fusarium verticillioides[1]。該病無季節(jié)性流行，導(dǎo)致甘蔗表現(xiàn)出不同程度受害，已給蔗糖業(yè)可持續(xù)性生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[2]。

在生物或非生物脅迫條件下，甘蔗蛋白的含量和種類會發(fā)生變化，其表達(dá)豐度或增或減，或產(chǎn)生新的蛋白。乙醇脫氧酶、類異黃酮還原酶、咖啡酸3-O-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸過氧化物酶、USP家族蛋白以及胱硫醚β-合酶參與甘蔗防衛(wèi)宿根矮化病菌反應(yīng)[3];甘蔗可溶性蛋白在鹽脅迫下的表達(dá)存在顯著差異[4];機械損傷誘導(dǎo)蛋白SUGARWIN2 在赤腐病、鳳梨病病原菌及酵母菌誘導(dǎo)下表達(dá)迥異[5];甘蔗拓補異構(gòu)酶，乙烯不敏感因子以及4次穿膜蛋白3個基因參與防御黑穗病菌侵染[6];蔗芽抗病性涉及活性氧代謝途徑和苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶活性的變化[7];病程相關(guān)蛋白PR-1和β-1，3葡聚糖酶等被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[8];甘蔗可能通過細(xì)胞色素C氧化酶基因的誘導(dǎo)，促使植保素合成增多，以此抵抗或抑制病原菌的脅迫[9]。甘蔗抗梢腐病菌F. verticillioides侵染研究表明二者相互作用機制涉及RNA、可溶性蛋白及氨基酸含量的精細(xì)調(diào)節(jié)[10]。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（Isobaric tag for relative and absolute quantitation，? iTRAQ）作為近年來發(fā)展的蛋白定量技術(shù)，其已成功應(yīng)用于解析甘蔗防御外界環(huán)境脅迫涉及的多系統(tǒng)、多水平代謝進(jìn)程[11]。為此，本文擬在上述研究基礎(chǔ)上，利用iTRAQ技術(shù)監(jiān)測梢腐病菌誘導(dǎo)的甘蔗葉片蛋白的表達(dá)水平變化，以獲得甘蔗響應(yīng)梢腐病菌侵染的差異蛋白表達(dá)譜，為解析甘蔗抗梢腐病生理生化機制提供全景掃描圖，進(jìn)而為發(fā)掘病程相關(guān)蛋白和抗病基因提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

室內(nèi)條件下種植高抗梢腐病品種YT94/128和高感品種GT37，待其5～6葉時，選取長勢一致植株利用針刺法[12]接種病原菌F. verticillioides，并遮蔭保濕，保持大棚溫度20～35 ℃，濕度80.00%～85.00%。于病情指數(shù)最嚴(yán)重階段即接種后第14天采集甘蔗+1葉（接種病原菌和清水的2個甘蔗品種，各3次生物學(xué)重復(fù)，共計12個樣品）經(jīng)液氮速凍，保存于80 ℃冰箱備用。

1.2? 方法

1.2.1? 蛋白質(zhì)提取及測定? 按照每106個細(xì)胞加約400 μL 裂解液的比例（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.1% PMSF，65 mmol/L DTT），在樣品中加入合適的裂解液，冰浴超聲（超聲5 s停10 s，超聲3～5 min）;冰上靜置40 min;14 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清。參考蘇亞春[8]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量和檢測。

1.2.2? 蛋白質(zhì)電泳、烷基化及酶解? SDS-PAGE電泳：取出需要的樣本量加入終濃度為10 mmol/L DTT，在56 ℃下反應(yīng)30 min后，加入終濃度20 mmol/L IAA室溫下避光反應(yīng)30 min;每管各加入預(yù)冷的丙酮（丙酮∶樣品體積比=5∶1），20 ℃沉淀2 h;12 000 r/min，4 ℃，離心20 min，取沉淀;加入含1 mol/L尿素的TEAB溶解液（dissolution buffer）20 μL，充分混勻溶解樣品;按照質(zhì)量比1∶50（酶∶蛋白）加入Trypsin，在37 ℃酶解15 h;酶解液加入終濃度0.5%的TFA終止酶解，濃縮凍干。

1.2.3? iTRAQ標(biāo)記及質(zhì)譜分析? 胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段;用0.5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，按照魏春燕[11]方法進(jìn)行iTRAQ（Applied Biosystems， Foster City， CA， USA）標(biāo)記。

高pH反相液相色譜法（RPLC）第一維分離：2.1 mm×150 mm XBridge BEH300（Waters公司，USA）;色譜儀器：Waters UPLC;A相：水（氨水、甲酸調(diào)至pH 10）;B相：100%CAN;紫外檢測波長：214～280 nm;流速：200 μL/min;梯度：60 min。根據(jù)峰型和時間共收取20個餾分，真空離心濃縮后，用50 μL RPLC A相溶解，進(jìn)行第二維分析。采用Triple TOF 5600（Applied Biosystem，USA）質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-TMS分析，采集軟件：Analyst TF（ABI，USA）;反相柱：ZORBAX 300SB C18 色譜柱（5 ?m，300 A，0.1 mm×150 mm，microm，USA）;色譜儀器：Eksigent 1D plus;色譜分離90 min;A： 5%CAN，0.1%甲酸;B：98% CAN，0.1%甲酸;流速：300 μL/min。

1.2.4? 蛋白質(zhì)鑒定及生物信息學(xué)分析? 應(yīng)用Mascot 2.3.02 軟件，在西南大學(xué)家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB（http：//silkworm.swu.edu.cn/silkdb/doc/ download.html）中進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定和定量。最終選擇肽段數(shù)≥2，表達(dá)水平差異倍數(shù)>1.0（上調(diào)）或<1.0（下調(diào)），且P<0.05的蛋白質(zhì)為顯著差異表達(dá)蛋白。選擇歐洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI）維護(hù)的QuickGO（http：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）注釋工具對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行基因功能聚類GO分析，把所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)向Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/）的各個條目映射，計算分布在每個條目的蛋白質(zhì)數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有蛋白質(zhì)背景相比在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO條目。Pathway通路顯著性富集分析方法與GO功能富集分析方法相同，以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有鑒定到的蛋白質(zhì)背景相比，在差異蛋白質(zhì)中顯著性富集的Pathway。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

接種梢腐病菌后，GT37與對照相比有542個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)表達(dá)187個，下調(diào)表達(dá)355個。YT94/128較之對照獲得差異蛋白449個，其中上調(diào)表達(dá)191個，下調(diào)表達(dá)258個。接種清水后，YT94/128較之GT37有131個差異蛋白下調(diào)表達(dá)，87個蛋白上調(diào)表達(dá)，而在接種病原菌后，YT94/128較之GT37有44個差異蛋白下調(diào)表達(dá)，151個蛋白上調(diào)表達(dá)。

2.2? 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能注釋

GT37中注釋到3707個蛋白，其中生物學(xué)過程（biological process）中蛋白數(shù)目最多的是代謝進(jìn)程（metabolic process），為322個;分子功能（molecular function）中蛋白數(shù)目最多的則是催化活性（catalytic activity），共計299個，細(xì)胞成分（cellular component）中蛋白數(shù)目最多的是細(xì)胞組分（cell part）和細(xì)胞（cell），二者均為419個。YT94/128中注釋到3068個蛋白，其中生物學(xué)過程中蛋白數(shù)目最多的是細(xì)胞進(jìn)程，為285個，分子功能中蛋白數(shù)目最多的是催化活性，為237個，細(xì)胞成分中蛋白數(shù)目最多的是細(xì)胞組分和細(xì)胞，二者均為345個。

2.3? 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG通路富集分析

GT37中主要富集的通路有光合生物體碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）、碳代謝（carbon metabolism）、戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway）、光合作用（photosynthesis）、氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）、丙酮酸鹽代謝（pyruvate metabolism）、亞油酸代謝（linoleic acid metabolism）、光合作用捕光蛋白（photosynthesis/antenna proteins）、乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）和代謝途徑（metabolic pathways）。YT94/128中主要富集的通路有亞油酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、光合作用、光合作用捕光蛋白、苯丙烷類生物合成、碳代謝、谷胱甘肽代謝、萜類物質(zhì)代謝、次生代謝物質(zhì)合成和丙酮酸鹽代謝。將通路富集信息與定量分析結(jié)果整合見表1，得到部分重要差異蛋白質(zhì)的基本信息，其中主要包括15個光合作用相關(guān)蛋白、25個氮代謝蛋白、6個萜類物質(zhì)代謝蛋白和6個植物-病原菌互作蛋白。

CK、JZ分別表示采用清水和孢子懸浮液接種第14天的樣品。

3? 討論

本文基于iTRAQ組學(xué)技術(shù)構(gòu)建了梢腐病菌侵染不同甘蔗材料的差異蛋白表達(dá)譜。代謝通路分析發(fā)現(xiàn)葉綠素a-b結(jié)合蛋白（Lhcb1-3）作為光合作用部位關(guān)鍵性成分在光捕獲和光調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[13]。此類蛋白下調(diào)表達(dá)，說明在病原菌誘導(dǎo)的衰老和死亡過程中控制PSⅡ-捕光復(fù)合體（PSⅡ-LHCⅡ）動力的類囊體結(jié)構(gòu)蛋白（THF1）受到負(fù)調(diào)控。三磷酸腺苷合成酶（ATP synthase，α、β、γ）作為病原菌侵染潛在受體在受到脅迫后上調(diào)表達(dá)，暗示梢腐病菌可通過影響宿主甘蔗ATP 合成酶的活性來擾亂其正常能量代謝。細(xì)胞色素b6f蛋白復(fù)合體（PetB和PetC）在PSⅠ和 PSⅡ反應(yīng)中心的產(chǎn)氧光合作用和跨膜電化學(xué)質(zhì)子梯度中為ATP合酶提供電路連接[14]，各類植物中，細(xì)胞核編碼因子在Cyt b6f復(fù)合體轉(zhuǎn)錄過程中是必不可少的，諸如玉米中的CRP1蛋白、衣藻屬的MCA1蛋白、以及擬南芥的PGR3、HCF152、HCF153蛋白。在光保護(hù)機制誘導(dǎo)下，過氧化物酶能協(xié)助清除過氧化氫，此類蛋白上調(diào)表達(dá)說明甘蔗在受到病原菌脅迫后，其葉片氧化還原反應(yīng)速度顯著加快。PSⅠ（由PsaC、PsaG和PsaL組成）參與電子傳遞和狀態(tài)轉(zhuǎn)換以維持高效光合作用，其大部分組合因子在藍(lán)藻細(xì)菌、真核藻類和CK、JZ分別表示采用清水和孢子懸浮液接種第14天的樣品。

高等植物中具有高度保守性[15]，除C5XAT4以外，大部分顯著上調(diào)表達(dá)，據(jù)此推斷C5XNG5、C5X3S4、A1E9X5以及PSⅠ的其他組成部分可能共同產(chǎn)生了一組聚合體，它們能確保對病原體侵染的快速響應(yīng)和光合效率的正常進(jìn)行。PSⅡ周圍的細(xì)胞色素蛋白參與環(huán)式電子傳遞調(diào)節(jié)，且對外界環(huán)境誘導(dǎo)有保護(hù)效應(yīng)。由此可見，光合作用機制自動響應(yīng)促使甘蔗調(diào)控適應(yīng)外界脅迫，避免真菌對正常代謝途徑的進(jìn)一步侵?jǐn)_，或使得甘蔗植株在受到較輕感染后能盡快恢復(fù)生長。相反，感病基因型甘蔗卻無法產(chǎn)生足夠的適應(yīng)性。

甘蔗葉片氮代謝通路積極響應(yīng)梢腐病菌的侵染[10]。C5Z0N4作為二氫硫辛酸脫氫酶以及C5WSJ3作為3-羥基異丁酰輔酶A水解酶參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑，而半胱氨酸是硫酸鹽同化作用的主要初級產(chǎn)物，硫素缺乏可導(dǎo)致葉片褪綠黃化、心葉伸長遲緩及花青素和大量細(xì)胞內(nèi)含物的積累，這與氮素供應(yīng)受限或紊亂所致癥狀極其相似，說明抗感差異材料中利用此類蛋白機制是迥然相反的。在β-丙氨酸代謝過程中，β-丙氨酸可能通過胺氧化酶（C5XCA6）、多胺氧化酶（C5YIG8）或谷氨酸脫羧酶（C5WMY2）進(jìn)行氧化脫氨基作用形成一些半醛，然后經(jīng)過重組參與丙酮酸代謝進(jìn)程，反過來又通過胺化作用產(chǎn)生β-丙氨酸。胺氧化酶（C5XCA6）和脯氨酸脫氫酶（C5WSJ9）在YT94/128中上調(diào)表達(dá)，在GT37中下調(diào)表達(dá)，表明抗病性更強的甘蔗材料可能具有更活躍的胺代謝分解。C5XPZ6作為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽水解酶以及C5WY74、C5WNQ0作為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在感抗植物中上調(diào)表達(dá)，表明它們在谷氨酸代謝中都扮演了非常重要角色。C5XPZ6又作為白三烯C4水解酶發(fā)揮重要作用，這說明該酶發(fā)揮的生理生化功能與甘蔗獲得系統(tǒng)性抗性有關(guān)。系統(tǒng)性抗性典型性特征表現(xiàn)為防御廣譜抗菌，并獨立于微生物或化學(xué)誘導(dǎo)物用于初級誘導(dǎo)。因此，進(jìn)一步鑒定花生四烯酸是否是為系統(tǒng)性抗性真正誘導(dǎo)者，或在甘蔗中體內(nèi)流動存在發(fā)揮作用是非常有必要的。

基于3-氨基丙腈具有抗病毒活性，因此氨腈代謝通路也被認(rèn)為與甘蔗抗梢腐病機制相關(guān)。C5Z796，作為一種胺裂解酶，在感抗材料中上調(diào)表達(dá)，尤其是在YT94/128中顯著上調(diào)，參與了賴氨酸代謝過程中L-天冬氨酸4-半醛和（2S， 4S）-4-羥基-2， 3， 4， 5-四氫二吡啶的反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞碳水化合物供應(yīng)被耗盡時，其可作為另一種呼吸底物發(fā)揮重要作用，而二氫吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）保持正常調(diào)節(jié)水平，賴氨酸是不會增長的[16]。在同批接種樣品中，感抗材料中不僅賴氨酸含量較對照顯著增長[10]，參與賴氨酸代謝進(jìn)程并起主要催化還原活性的C5Z796蛋白也顯著上調(diào)表達(dá)。因此，C5Z796蛋白被認(rèn)為是甘蔗與病原菌互作的一種特征性蛋白。

萜類化合物由于其揮發(fā)性、風(fēng)味/香氣和毒性等特性，在植物防御中發(fā)揮重要作用 [17]。通路富集分析表明萜類蛋白C5XAU4作為焦磷酸-δ-異構(gòu)酶參與類異戊二烯及甾醇生物合成，C5XHL1作為催化酶參與香葉酸合成，C5YB59參與脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、法內(nèi)二磷酸及異戊烯半胱氨酸的合成，C5X5D5參與脫落酸信號途徑的負(fù)調(diào)控、蛋白的法尼基化修飾、香葉酰香葉?；?、分生組織的形成及水分喪失響應(yīng)過程，C5X0Z0將乙酰輔酶a與乙酰輔酶a結(jié)合形成β-羥基-β-甲戊二酸單酰輔酶a。這些反應(yīng)都是在一系列萜烯合成酶催化下進(jìn)行，中間合成產(chǎn)物有許多是次生代謝產(chǎn)物，它們可以保護(hù)甘蔗不受梢腐病菌的侵害。在受感染的植物中，萜烯的生物合成被抑制，降低了植物抗性，增強了病毒的傳播性能[18]?；诖?，針對萜類化合物是否能作為毒素抑制梢腐病菌的生殖和繁育、是否存在特定的萜烯化合物使梢腐病菌產(chǎn)生排斥反應(yīng)影響對不同遺傳背景甘蔗的選擇行為以及是否存在特定的萜烯化合物通過吸引天敵（內(nèi)生菌）間接防御梢腐病菌的侵染這一系列問題開展進(jìn)一步探討是非常有必要的。

植物寄主抗病性與其合成的多肽有關(guān)。蛋白C5YJ75和C5X3T9具有ATP酶活性，可能與RAR1結(jié)為協(xié)同分子伴侶積極參與RPM1介導(dǎo)的抗性機制。前人已通過大麥白粉病研究發(fā)現(xiàn)了RAR1蛋白在抗病信號中的作用[19]，在一些屬于NBS-LRR家族的基因（12， 36-38）中，也發(fā)現(xiàn)了同樣的作用[20]。此外，Hsp90可以穩(wěn)定RPM1并保護(hù)它不受Sgt1介導(dǎo)的降解，在無熱休克情況下通過主動抑制熱休克轉(zhuǎn)錄因子功能，對熱誘導(dǎo)基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控[21]。C5XEC3被注釋為Sgt1 disease resistance protein，暗示其可能參與植物與病原菌的互作進(jìn)程。所有外界環(huán)境變化都可導(dǎo)致第二信使鈣（Ca2+）信號的產(chǎn)生[22]，鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs），代表潛在的Ca2+解碼器以轉(zhuǎn)化發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激信號。蛋白C5XBP4通過參與ATP的結(jié)合、催化鈣依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性以及與Ca2+和鈣調(diào)蛋白的結(jié)合積極參與脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基絲氨酸磷酸化以及蛋白自身磷酸化等生理過程，表明其可能在快速響應(yīng)病原菌脅迫，且在植物激素調(diào)節(jié)適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。前人通過對大豆鈣調(diào)蛋白（CaMs）的過度表達(dá)研究，證明了CaM參與植物防御反應(yīng)的直接證據(jù)[23]。在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中，SCaM4和SCaM5的表達(dá)會導(dǎo)致自發(fā)損傷，增加PR基因表達(dá)，增強對細(xì)菌、真菌和病毒病原體的抵抗力[24]。有趣的是，沉默煙草中的一個CaM（Nb-CaM1），抑制煙草細(xì)胞中煙草花葉病毒p50誘導(dǎo)的HR，而不是Cf9-Avr9或Pto-AvrPto和pst dc3000誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，說明CaM可以對不同的病原體產(chǎn)生特異性[25]。這表明CaMs在植物防御中起著至關(guān)重要的作用，也暗示了鈣調(diào)蛋白C5YMD2以及C5XQS6在甘蔗材料中有助于防御梢腐病菌的進(jìn)一步侵染。

綜上所述，遺傳背景不同的甘蔗品種在蛋白質(zhì)組成上有很大差異，這可能是不同甘蔗品種間抗梢腐病性差異的重要分子基礎(chǔ)。而光合作用電子傳遞蛋白C5YLG2、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶C5XPZ6、胺氧化酶C5Z796以及鈣調(diào)蛋白C5YMD2作為高豐度差異表達(dá)蛋白，應(yīng)可視為潛在重要抗病相關(guān)蛋白，其表達(dá)特性和功能特征有必要進(jìn)一步深入研究。

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