高靈敏共振光散射技術(shù)測定藥物及尿樣中氨曲南

何樹華, 曾慶瑞, 程乙真, 吳文婕, 江 虹

(長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，長江師范學(xué)院武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 408100)

氨曲南(Aztreonam,ATN)是目前投入市場的第一個應(yīng)用于臨床的新型單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，該藥對革蘭陰性菌具有很強的抗菌活性，臨床上主要用于治療革蘭陰性菌引起的各種感染，如由敏感菌所引起的呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、生殖系統(tǒng)感染、皮膚感染及其它嚴重感染等。氨曲南的不良反應(yīng)，如腹瀉、惡心、嘔吐、黃疸、藥物性肝炎、紫癜、皮疹等均較少見，但用藥過量或長期使用該藥時，會對肝、腎功能及造血系統(tǒng)造成較嚴重的影響。因此，研究測定ATN含量的方法，對于保障用藥安全具有重要意義。

目前，國內(nèi)外對ATN含量的檢測方法研究較少，已報道的主要是高效液相色譜法[1 - 6]，也偶有原子吸收法[7]、熒光法[8 - 9]、電化學(xué)法[10]及液-質(zhì)聯(lián)用法[11]等的報道。本工作以常見的堿性染料維多利亞藍B(VIB)為探針，用高靈敏共振光散射(RLS)技術(shù)測定ATN的含量，尚未見文獻報道。實驗發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，ATN與VIB締合物的RLS強度與ATN的濃度間有一定的線性關(guān)系。方法用于檢測藥物及人體尿液中ATN的含量，獲得較好結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計，日本日立公司；pHS-3C型酸度計，上海虹益儀器儀表有限公司。

氨曲南對照品(ATN)(96.9%，批號：130507-201303，中國食品藥品檢定研究院)溶液：準確稱取適量的ATN對照品于小燒杯中，加少許甲醇使其溶解，再轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用水定容，配成43.54 mg/L的貯備溶液，于冰箱4 ℃保存，臨用時稀釋成4.354 mg/L操作液。維多利亞藍B(VIB)(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)溶液：1.0×10-4mol/L。Tris-HCl緩沖溶液：分別取0.10 mol/L HCl和0.20 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液適量，混合后，用酸度計測定其pH值，配成pH=3.0～9.8的系列溶液。實驗用水是二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

依序準確移取pH=9.34 Tris-HCl溶液3.00 mL，4.354 mg/L ATN標準溶液(或樣液)適量，1.00×10-4mol/L VIB溶液3.00 mL于10 mL具塞比色管中，加水定容，5 min后，在熒光光度計上，于λex=λem=220 nm處(測定狹縫5.0 nm)，同步掃描體系的共振光散射(RLS)光譜，測定最大散射波長處，體系溶液及試劑空白溶液的RLS強度IRLS及I0，并計算ΔIRLS(ΔIRLS=IRLS-I0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 ATN-VIB的RLS光譜特征

圖1 氨曲南與維多利亞藍B的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of aztreonam and victoria blue B1.0.435 mg/L ATN;2.3.00×10-5 mol/L VIB;3 - 9:0.0,0.0871,0.174,0.261,0.348,0.435,0.523 mg/L ATN-3.00×10-5 mol/L VIB, pH=9.34.

ATN與VIB反應(yīng)體系的RLS光譜見圖1。從圖可知，ATN和VIB本身的RLS光譜均很微弱(曲線1和2)，當(dāng)它們在pH=9.34的堿性條件下反應(yīng)生成締合物后，共振光散射強度明顯增強，最大共振散射峰位于370 nm，在此波長下，共振光散射強度IRLS隨著ATN濃度的增大而增強(曲線3～9)，并且ATN在一定濃度范圍內(nèi)與IRLS的增強強度呈線性關(guān)系，故該方法可用于ATN的定量分析。

反應(yīng)機理：VIB在溶液中以陽離子形式存在，而ATN分子結(jié)構(gòu)中有一個磺酸根離子和一個羧酸根離子，在溶液中VIB與ATN可以靜電引力結(jié)合生成二元離子締合物，使體系摩爾質(zhì)量增大(由原來ATN的摩爾質(zhì)量增大到ATN與VIB結(jié)合生成的締合物的摩爾質(zhì)量)，故體系的RLS明顯增強。

2.2 反應(yīng)條件

2.2.1 溶液pH的影響室溫下，試驗了甲基紫-ATN、堿性品紅-ATN及VIB-ATN體系在同一酸性或同一堿性條件下對RLS的影響。結(jié)果表明，在堿性Tris-HCl介質(zhì)中，VIB-ATN體系有較強的RLS信號，故選用VIB作探針測定ATN。繼而改變反應(yīng)體系中Tris-HCl溶液的pH值，考察其對ΔIRLS的影響，結(jié)果見圖2。反應(yīng)在pH=8.5～9.8范圍內(nèi)，體系有較大且較穩(wěn)定的ΔIRLS，即有較高的靈敏度。實驗選用pH=9.34，當(dāng)緩沖溶液用量為3.00 mL時，體系ΔIRLS相對最大且穩(wěn)定。故實驗用pH=9.34的Tris-HCl溶液3.00 mL來控制反應(yīng)的酸度。

2.2.2 VIB溶液濃度的影響室溫下，改變反應(yīng)體系中VIB溶液的濃度，考察其對ΔIRLS的影響，結(jié)果見圖3。VIB溶液濃度在2.70×10-5～3.30×10-5mol/L范圍內(nèi)，體系有較大且穩(wěn)定的ΔIRLS，濃度為3.00×10-5mol/L時ΔIRLS達最大，靈敏度最高。VIB溶液的濃度大于或小于3.00×10-5mol/L，反應(yīng)體系的ΔIRLS均有不同程度的降低。降低原因是：要么反應(yīng)不完全，要么VIB過量使自身聚集作用增大，從而導(dǎo)致體系ΔIRLS有所降低。故實驗用1.00×10-4mol/L VIB溶液3.00 mL來保障方法有高的靈敏度。

圖2 pH值對ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

圖3 維多利亞藍B溶液濃度對ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of victoria blue B concentration on ΔIRLS

2.2.3 試劑加入順序的影響室溫下，改變反應(yīng)體系中試劑的加入順序，考察其對ΔIRLS的影響。實驗表明，靈敏度相對較高時，試劑加入順序為：Tris-HCl溶液、ATN溶液、VIB溶液，反應(yīng)體系的ΔIRLS相對最大。

2.2.4 反應(yīng)速度及RLS強度的穩(wěn)定性室溫下，改變反應(yīng)體系中ATN和VIB溶液的反應(yīng)時間，考察其對ΔIRLS的影響。實驗表明，ATN和VIB的反應(yīng)5 min即可完成，穩(wěn)定時間至少1 h。實驗選在5 min后測定。

2.3 共存物質(zhì)的影響

圖4 標準曲線Fig.4 Calibration curve

2.4 ATN濃度與ΔIRLS的關(guān)系

在選定的最佳實驗條件下，按實驗方法配制ATN標準系列溶液，掃描RLS光譜。作ATN的工作曲線(ΔIRLS-c曲線)，如圖4所示。反應(yīng)體系的ΔIRLS與ATN的質(zhì)量濃度在0.003～0.52 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:ΔIRLS=-7.236+625.6c(mg/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.9988，檢出限(3Sb/S)為0.0023 mg/L，可見方法有較寬的線性范圍及很高的靈敏度。

2.5 樣品分析

2.5.1 樣液的制備取重慶某藥業(yè)股份有限公司和山西某藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射用ATN各1支(分別編為1#和2#)，將全部內(nèi)容物分別置于小燒杯中，加少許甲醇攪拌，待ATN溶解后，轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，加水定容。取1#和2#定容液各5.00 mL，分別用水稀至1 000 mL，即為1#和2#待測液。取健康人體新鮮尿液(編為3#)適量，過濾后稀釋10倍，即得待測液。

2.5.2 樣液的測定及回收試驗取1#待測液0.50 mL，2#待測液0.20 mL，3#待測液2.00 mL，分別按實驗方法測定各樣品中ATN的含量(各平行測定5份)。再做3種不同加標梯度的回收試驗(各梯度平行測定5份)，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果及回收試驗(n=5)

ND：notdetected.

3 結(jié)論

用共振光散射技術(shù)測定ATN的含量具有高靈敏度和高選擇性，較寬線性范圍，較高準確度和精密度；所用儀器只需一般的熒光分光光度計，易于普及，所需藥品為一般常用試劑，分析成本低。該方法適于藥物及人體尿液中ATN含量的定量分析。