氣相色譜-質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法研究血必凈注射液對百草枯中毒大鼠的治療作用

李 莎， 祝益民， 劉 文*,， 伍洋科， 蔣菲婭， 顏 笑

(1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410013；2.湖南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長沙 410005；3.危急重癥代謝組學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410005)

百草枯(Paraquat，PQ)是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的非選擇性、接觸性、低污染、低殘留的一種廣譜高效除草劑。它不僅對植物有毒，對人類和動(dòng)物也有很大的毒性[1 - 2]。攝入超過20 mL的20%PQ水劑會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)、多器官衰竭和心源性休克而致死；攝入較小的劑量也會(huì)導(dǎo)致死亡，但過程較慢可能需要數(shù)周時(shí)間，并且由過度和不可逆轉(zhuǎn)的肺纖維化和腎衰竭發(fā)生而致死[3]。PQ患者中毒后會(huì)累及多器官損傷，其中肺是百草枯的主要毒性靶標(biāo)；PQ中毒引起的肺損傷最初表現(xiàn)為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，隨后發(fā)展為廣泛的纖維化[4]。目前臨床上主要治療手段是血液灌注、血液透析，合用免疫調(diào)節(jié)、抗氧化治療[5]，但是由于百草枯固有的毒性以及缺乏特效解毒劑，其預(yù)后致死率依然很高。

血必凈注射液(XBJ)是一種從赤芍、川芎、丹參、紅花和當(dāng)歸5味中草藥中提取的中藥制劑，它具有清除氧自由基、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗炎性介質(zhì)、拮抗內(nèi)毒素等作用，主要用于治療與炎癥有關(guān)的間質(zhì)性疾病[6]。血必凈聯(lián)合血液灌注治療百草枯中毒有助于改善患者器官功能障礙并阻止肺纖維化的發(fā)生，從而降低死亡率[7]，這在一定程度上表明當(dāng)機(jī)體暴露于百草枯后，血必凈注射液聯(lián)合其他治療手段可以對機(jī)體起到一定的保護(hù)作用，但并不能直觀、全面的評價(jià)血必凈的治療效果。

代謝組學(xué)(Metabolomics)作為系統(tǒng)生物學(xué)研究的前沿技術(shù)和方法，通過識別生命系統(tǒng)中全部生物化學(xué)變化的代謝特征，為我們提供了一個(gè)了解疾病和藥物作用的新視角，可以從更全面、直觀的角度來評價(jià)藥物的治療作用[8]。而氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)是代謝組學(xué)應(yīng)用于非靶向代謝組學(xué)的常規(guī)技術(shù)，具有分離效果好、靈敏度高、易于定性定量[9 - 10]。本研究采用GC-MS代謝組學(xué)方法來探索血必凈注射液對百草枯中毒大鼠肺損傷的治療效果和代謝影響。研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠肺組織發(fā)生了明顯的病理改變，百草枯中毒大鼠相比于正常大鼠，其血漿中內(nèi)源性代謝物變化最顯著的有7種，L-纈氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亞油酸、L-色氨酸5種的含量相對增加，而D -果糖、麥芽糖2種的含量則降低。血必凈注射治療后可對5種生物標(biāo)志物含量進(jìn)行回調(diào)，從而達(dá)到對抗百草枯毒性反應(yīng)的作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Aglient 7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，安捷倫公司)，Aglient MSD ChemStation工作站和NIST 14質(zhì)譜庫；5415R高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge公司)；MX-F漩渦混合器(美國，SCILOGEX公司)。

20%PQ溶液(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司)；血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司)；甲醇(色譜純，美國Sigma公司)；N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，內(nèi)含1%TMCS)(美國AccuStandard公司)；O-甲基羥胺鹽酸鹽、脯氨酸、草酸、棕櫚酸、葡萄糖、膽固醇均購自北京百靈威科技有限公司；吡啶、2-異丙基蘋果酸購自美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處置

SD雄性大鼠36只，體重200～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證：SCXK(湘)2016-0002)，飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、PQ組、血必凈干預(yù)組三組，然后將每組再分為1 d、7 d亞組，每組6只。對照組灌胃1 mL生理鹽水；PQ組一次性灌胃40 mg/kg[11 - 12]PQ染毒；血必凈組于灌胃2 h后尾靜脈注射血必凈注射液8 mL/(kg·d)[13]；對照組和PQ組尾靜脈注射等量生理鹽水。均給藥7 d，每日觀察大鼠活動(dòng)情況。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 樣本收集

于末次給藥干預(yù)后的第2 d用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，收集心臟血并離心，提取上清液分裝成每管200 μL至1.5 mL離心管中，于-80 ℃儲存直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。開胸取出雙側(cè)肺組織，將右側(cè)下葉組織浸泡于10%的中性甲醛中用于蘇木精-伊紅(HE)染色；其余肺組織分別裝于1.5 mL EP管中速凍于液氮中，然后-80 ℃儲存直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 HE染色

將肺組織在10%的中性福爾馬林中固定48 h，包埋在石蠟中并切成3 μm切片。使用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 樣本處理

按照文獻(xiàn)方法[14]進(jìn)一步優(yōu)化樣品前處理步驟。取200 μL血漿樣本于4 ℃解凍后，每份加入20 μL異丙基蘋果酸-甲醇溶液(內(nèi)標(biāo)，1 mg/mL)，渦旋20 s，加入600 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋20 s，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液置于10 mL玻璃離心管中，常溫下氮?dú)獯蹈珊?，加?00 μL甲氧胺-吡啶溶液(20 mg/mL)，渦旋45 s，70 ℃水浴肟化1 h；加入100 μL硅烷化試劑N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，內(nèi)含1%TMCS)，渦旋45 s，70 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，取100 μL于200 μL內(nèi)襯管的進(jìn)樣小瓶中，用于GC-MS 分析，進(jìn)樣量1 μL。

1.6 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為安捷倫HP-5MS熔融石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；采用程序升溫的方式以70 ℃作為起始溫度，保持2 min后，以8 ℃/min的速率升至140 ℃，然后以5 ℃/min的速率升至240 ℃，再以10 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min；分流比：10∶1；柱流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣為氦氣。

質(zhì)譜條件：EI離子源溫度250 ℃；電離能量70 eV；接口溫度270 ℃；掃描模式：全掃描，(m/z12～400)；掃描間隔 0.2 s；溶劑切除時(shí)間為5 min。

1.7 分析方法驗(yàn)證和質(zhì)量控制(QC)

為了確保樣本分析的精確性和可重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)采用了混合5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品用于樣品制備過程和儀器穩(wěn)定性測試。此外將所有樣品等體積血漿(200 μL)制備合并的QC樣品，將這些QC樣品與研究樣品一起分析[15 - 16]。在研究樣品序列之前先連續(xù)注3針QC樣品評估儀器穩(wěn)定性，每6個(gè)研究樣品注射1個(gè)QC樣品評估重復(fù)性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Aglient MSD chemstation工作站對GC-MS總離子流圖中的各種代謝物的峰面積進(jìn)行積分，以相對峰面積(目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)2-異丙基蘋果酸峰面積之比)表示代謝物的相對含量；利用NIST數(shù)據(jù)庫對血漿中的代謝物進(jìn)行鑒定，得到GC-MS數(shù)據(jù)；使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析，得到差異代謝物。

2 結(jié)果與討論

2.1 血必凈注射液對百草枯誘導(dǎo)的病理變化

如圖1所示，對照組的肺組織顯示無明顯病理變化，相反在PQ組的肺中，呈現(xiàn)了廣泛的形態(tài)學(xué)肺損傷，例如間質(zhì)水腫，肺泡出血，且隨時(shí)間變化呈現(xiàn)肺泡壁增厚，炎性細(xì)胞浸潤，甚至組織破壞。然而，用血必凈處理后可減弱肺中PQ誘導(dǎo)的病理損傷(血必凈組)。

圖1 血必凈對百草枯誘導(dǎo)的病理變化Fig.1 Pathological changes of paraquat induced by XuebijingA-1 d；B:7 d(HE×200).

2.2 代謝組學(xué)分析

2.2.1 方法學(xué)考察本研究采用混合標(biāo)準(zhǔn)品來考察儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性，包括有機(jī)酸(草酸)、氨基酸(脯氨酸)、糖類(葡萄糖)、脂肪酸(棕櫚酸)及膽固醇，結(jié)果見表1。從表中可看出，其中4種標(biāo)準(zhǔn)品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%，膽固醇的RSD也小于15%。說明實(shí)驗(yàn)過程中的誤差在可接受范圍之內(nèi)，儀器穩(wěn)定性也良好。本研究同時(shí)采用QC樣本對實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行考察，其結(jié)果顯示QC樣本中50個(gè)代謝物中大部分物質(zhì)在肟化-硅烷化條件下表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性(RSD <20%)，符合方法學(xué)的要求。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的RSD(n=5)

圖2 不同組別的總離子流(TIC)色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of different groups*chromatographic peaks attribution are shrown in Table 2.

2.2.2 代謝圖譜解析圖2是不同組別的總離子流(TIC)色譜圖，從圖中可以看出不同組別之間的差異。本實(shí)驗(yàn)通過NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫和標(biāo)準(zhǔn)品對大鼠血漿中的代謝物進(jìn)行定性分析，共分辨出62個(gè)色譜峰，鑒定出氨基酸、糖類、脂肪酸、有機(jī)酸等50種代謝物質(zhì)，結(jié)果見表2。并通過代謝物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行相對定量分析，結(jié)果顯示三組大鼠血漿代謝物質(zhì)基本相同，但其含量存在差異。

表2 GC-MS檢測到的大鼠內(nèi)源性物質(zhì)

圖3 不同組大鼠血漿的PCA-3D圖Fig.3 PCA-3D diagram of plasma in different groups of ratsA:1 d;B:7 d.

2.2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析本文采用主成分分析法(PCA)對各組大鼠的代謝信息進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)治療后第1 d，PQ組與血必凈干預(yù)組并未能達(dá)到很好的分離，說明在血必凈干預(yù)1 d后其治療效果并不明顯(圖3A)；經(jīng)治療7 d后，PQ組與血必凈組能得到較佳的分離效果，且血必凈組遠(yuǎn)離模型組，向正常對照組靠近，表明在給藥后7 d血必凈表現(xiàn)出一定的抗PQ中毒效果(圖3B)。為了進(jìn)一步分析其差異代謝物，運(yùn)用SMICA 13.0軟件對第7 d的數(shù)據(jù)進(jìn)行變量重要性投影分析(VIP)，得到VIP值大于1.0的20種代謝物，并將對照組與PQ組的這20種代謝物進(jìn)行t-test分析，得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的7種代謝物，其結(jié)果見表3。

表3 差異性代謝物的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(n=6)

Note:↑forincrease；↓fordecrease；*forp<0.05；**forp<0.01；/forp>0.05.

從表3可見，百草枯中毒大鼠相比于對照組，其血漿中內(nèi)源性代謝物變化最顯著的有7種，L-纈氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亞油酸、L-色氨酸5種的含量在百草枯中毒組增加，而D -果糖、麥芽糖2種的含量則下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道[17]的大致相似。L-纈氨酸、琥珀酸、L-纈氨酸是蛋白質(zhì)和脂肪的代謝產(chǎn)物，亞油酸是人體營養(yǎng)中必需的脂肪酸，而D -半乳糖是一種提供能量的營養(yǎng)素，D -果糖、麥芽糖是糖代謝的產(chǎn)物，這表明百草枯中毒后蛋白質(zhì)和脂肪的代謝作用增強(qiáng)，脂肪酸代謝增強(qiáng)，而能量代謝減弱。用血必凈注射液治療后，大鼠血漿中L-纈氨酸、琥珀酸、D -半乳糖、亞油酸、L-色氨酸的含量得到回調(diào)，與對照組無明顯差異，說明血必凈注射液通過調(diào)節(jié)體內(nèi)部分氨基酸代謝、脂肪酸代謝和能量代謝對抗百草枯的毒性反應(yīng)。

3 結(jié)論

在本研究中，使用基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，在對照組與百草枯組之間鑒定出7種差異代謝物，這些生物標(biāo)志物調(diào)節(jié)能量代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和糖代謝。血必凈注射液可以通過逆轉(zhuǎn)代謝紊亂來減輕大鼠的肺損傷，并且初步確認(rèn)了血必凈調(diào)節(jié)的5種生物標(biāo)志物。該研究可以促進(jìn)對百草枯中毒的發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步理解，從而促進(jìn)靶向篩選治療藥物。此外，闡明血必凈注射液對百草枯中毒的代謝調(diào)節(jié)作用，可為其在臨床實(shí)踐中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。