肺癌耐順鉑細胞A549/CIS產(chǎn)生腫瘤干細胞特性的分子機制研究

王昊，趙亮 ，王東升

作者單位：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院,a檢驗科,b呼吸科，安徽 合肥 230001

肺癌是全球發(fā)病率和病死率較高的一種惡性腫瘤，晚期肺癌的5年生存率較差，主要原因是化療耐藥性的產(chǎn)生?；熓侵委煼伟┑闹匾椒ǎ樸K(cisplatin)是肺癌化療的首選藥物，順鉑與腫瘤細胞中DNA交叉連接，形成復(fù)合物，阻斷腫瘤細胞DNA的復(fù)制，最終引起腫瘤細胞凋亡[1]。肺癌病人經(jīng)過初期順鉑化療后，腫瘤進程得到控制，但經(jīng)過一段時間的持續(xù)給藥治療后，就會對順鉑的敏感性降低，獲得耐藥性，最終達不到預(yù)期治療效果。

腫瘤干細胞(cancer stem cell)是一類存在于腫瘤組織中的細胞，它們具有自我更新的能力，并且可以分化成為不同家族的腫瘤細胞構(gòu)成整個腫瘤[2]。腫瘤細胞具有腫瘤干細胞表型后可以獲得更強的微球形成能力，分化成其他類型的腫瘤細胞，腫瘤干細胞表型的獲得是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特性，也是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素[3]。近年來，有文獻報道稱腫瘤干細胞表型可以促進腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生，同樣地，耐藥細胞株也獲得了更強的腫瘤干細胞特性，表明腫瘤干細胞表型與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)[3]，然而，其中的分子機制并不明確。本研究2015年9月至2016年9月檢測了肺癌耐藥株和親本株細胞的腫瘤干細胞表型，并對其中的分子機制進行了探討，以期為深入理解腫瘤化療耐藥和腫瘤干細胞表型的關(guān)系提供一些有益的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)肺癌細胞A549和耐藥株A549/CIS由本實驗室培養(yǎng)。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑順鉑和LY294002購自Sigma-Aldrich公司；western蛋白裂解液購自碧云天；熒光定量-PCR試劑和CCK8試劑購自合肥颯英思生物技術(shù)公司；抗體pAKT、AKT、p65、p-p65、pMAPK-p38和MAPK-p38購自Cell Signaling Technology公司；抗體GAPDH購自武漢三鷹生物公司。

1.3 微球形成實驗A549和A549/CIS細胞以1 000/mL的密度接種于12孔低吸附細胞培養(yǎng)板，設(shè)置3個復(fù)孔，加入1 mL微球形成培養(yǎng)基(無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1×B27試劑、終濃度為20 ng/mL的EGF、終濃度為20 ng/mL的bFGF、終濃度為5 g/mL的胰島素、終濃度為1 g/mL的氫化可的松以及1%的雙抗)，每隔3天補加一定量新鮮的微球形成培養(yǎng)基，培養(yǎng)9 d后，在顯微鏡下觀察微球形成情況，對每個培養(yǎng)孔中的微球(>20 μm)進行計數(shù)并拍照。

1.4 Western blotting檢測A549和A549/CIS細胞經(jīng)相應(yīng)的處理后，用預(yù)冷PBS輕輕洗滌3次，冰上用Western蛋白裂解液裂解15 min，12 000 r/mim離心20 min收集上清；用BCA方法對蛋白進行定量，每組用等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，200 mA恒定電流電轉(zhuǎn)90 min將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉孵育2 h，抗體均以1∶1 000比例4 ℃孵育過夜，經(jīng)PBST洗滌3次后，加入二抗以1∶5 000室溫孵育1.5 h，PBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在Western自動曝光儀中曝光。

1.5 CCK8實驗A549和A549/CIS細胞經(jīng)相應(yīng)的處理后，以每孔8×103/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板，第2天貼壁生長后用不同濃度順鉑處理細胞，設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)立DMSO作為LY294002的對照組。加藥處理細胞24 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 mL新鮮培養(yǎng)基，同時每孔加入10 mL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀在450 nm激發(fā)光波長處檢測OD值，去除每組中的最大值和最小值，以平均值來計算細胞存活率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 A549/CIS細胞獲得更強的腫瘤干細胞特性利用微球形成實驗比較A549和A549/CIS細胞的腫瘤干細胞特性，結(jié)果顯示，在低吸附細胞培養(yǎng)板中生長9 d后，與A549細胞相比，A549/CIS細胞的分化生長能力更強，形成的微球數(shù)目明顯增多(圖1)。

圖1 微球形成實驗比較A549和A549/CIS細胞的腫瘤干細胞特性(×200)

2.2 A549/CIS細胞中AKT信號通路被激活我們進一步研究了耐藥細胞獲得腫瘤干細胞特性的分子機制，檢測了親本株和耐藥株細胞中與腫瘤干細胞表型相關(guān)信號通路AKT、p65和MAPK-p38的活化情況。Western blotting結(jié)果顯示(圖2)：與A549細胞相比，A549/CIS細胞中磷酸化p65和MAPK-p38的程度沒有明顯改變，而磷酸化AKT的程度明顯增加，提示了AKT信號通路的激活可能在耐藥細胞獲得腫瘤干細胞表型的過程中發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。

圖2 A549/CIS細胞中AKT信號通路被激活Western blotting實驗比較A549和A549/CIS細胞中AKT、p65和MAPK-p38信號通路的磷酸化情況

2.3 LY294002逆轉(zhuǎn)了A549/CIS細胞的腫瘤干細胞表型為了進一步研究AKT信號通路的激活在耐藥細胞獲得腫瘤干細胞表型過程中的作用，我們使用了AKT信號通路的抑制劑LY294002處理A549/CIS細胞，并檢測對AKT、p65和MAPK-p38信號通路的影響，結(jié)果顯示，LY294002抑制了AKT信號通路的磷酸化，而對p65和MAPK-p38信號通路的活化沒有明顯影響(圖3A)。隨后我們檢測了LY294002對A549/CIS細胞獲得腫瘤干細胞表型的影響，微球形成實驗結(jié)果顯示，LY294002處理減少了A549/CIS細胞的微球形成能力(圖3B)。這些結(jié)果共同表明，AKT信號通路的活化在肺癌耐藥細胞獲得腫瘤干細胞表型過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

圖3 LY294002對A549/CIS細胞腫瘤干細胞特性的影響:A為Western blotting實驗檢測LY294002對A549/CIS細胞中AKT、p65和MAPK-p38信號通路的影響；B為微球形成實驗檢測LY294002對A549/CIS細胞腫瘤干細胞特性的影響(×200)

2.4 LY294002降低了A549/CIS細胞對順鉑的耐受性最后，我們研究了AKT信號通路的激活對于A549/CIS細胞獲得順鉑耐藥性的影響。用梯度濃度的順鉑聯(lián)合LY294002處理A549/CIS細胞48h，結(jié)果顯示，與對照組相比，LY294002可以降低A549/CIS細胞對順鉑的耐受性(圖4)。

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)危害較大的腫瘤，化療是目前治療肺癌的主要方法之一，順鉑是目前治療肺癌的重要化療藥物，而耐藥性的產(chǎn)生最終導(dǎo)致了肺癌的治療失敗。近年來，腫瘤干細胞特性和化療耐藥之間的相關(guān)性被廣泛研究。一些耐藥的腫瘤細胞比不耐藥的親代細胞具有更強的腫瘤干細胞特性，比如，對順鉑耐藥的非小細胞肺癌展示出了腫瘤干細胞特性[4]；對抗凋亡的胰腺癌細胞獲得了腫瘤干細胞特性和微球形成能力，表達腫瘤干細胞相關(guān)基因[5]。而具有腫瘤干細胞特性的細胞會抵抗腫瘤化療和放療治療[6-8]。這些研究表明化療耐藥性和腫瘤干細胞特性之間存在密切關(guān)系。本研究檢測了人肺癌耐順鉑細胞A549/CIS和親本細胞A549的腫瘤干細胞特性變化，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比，耐藥細胞的微球形成能力明顯增強，表明其獲得了更強的腫瘤干細胞特性。

圖4 LY294002對A549/CIS細胞對順鉑耐受性的影響(F=9.135)

腫瘤干細胞特性的獲得涉及復(fù)雜的機制，許多信號通路涉及腫瘤產(chǎn)生干細胞特性的過程中，為腫瘤細胞傳遞重要的信號信息，其中，PI3K/AKT、MAPK-p38以及NF-κB信號通路與腫瘤干細胞特性的獲得密切相關(guān)[9-11]。本研究檢測了A549細胞和A549/CIS細胞中AKT、p65以及MAPK-p38信號通路的激活情況，發(fā)現(xiàn)與親本細胞相比，耐藥細胞A549/CIS中AKT通路明顯被激活，而p65和MAPK-p38信號通路沒有明顯改變。近年來，不斷有研究證明PI3K/AKT 信號通路的異常激活貫穿了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段并發(fā)揮重要調(diào)控作用。miR-106b-5p通過激活PI3K/AKT信號通路，促進靶蛋白PTEN蛋白的表達，誘導(dǎo)肝癌細胞產(chǎn)生腫瘤干細胞特性[9]；PI3K/AKT/c-MYC信號通路軸的激活調(diào)控了食管鱗狀細胞癌獲得腫瘤干細胞表型的過程[12]。此外，PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和分化等方面具有重要作用[13]。結(jié)合研究的發(fā)現(xiàn)，我們推測PI3K/AKT 信號通路在肺癌細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性以及耐藥細胞獲得干細胞特性過程中發(fā)揮了重要作用。我們使用了PI3K/AKT 通路抑制劑LY294002，發(fā)現(xiàn)它抑制了A549/CIS細胞的微球形成能力，減少其腫瘤干細胞特性，同時降低了A549/CIS細胞對順鉑的耐受性，這些結(jié)果共同表明PI3K/AKT 信號通路的激活在肺癌耐藥細胞獲得腫瘤干細胞特性以及耐藥性方面發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用。本研究的不足之處是未能更加深入的探討PI3K/AKT 信號通路是如何影響耐藥細胞獲得干細胞特性的，干細胞特性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Nanog、Oct4、BMI-1等在維持干細胞特性上發(fā)揮了重要作用，下一步的研究方向重點將探討PI3K/AKT 信號通路是否通過影響了這些轉(zhuǎn)錄因子的表達而調(diào)控了耐藥細胞的干細胞特性。

總結(jié)來說，我們證明了人肺癌耐順鉑細胞株A549/CIS相對于親本株獲得更強的腫瘤干細胞特性，而AKT 信號通路的激活在其中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，抑制AKT 信號通路，可以減少A549/CIS 細胞的干細胞特性并降低其對順鉑的耐受性，這些研究為肺癌的臨床治療提供可供參考的作用靶點和潛在的臨床應(yīng)用價值。